ウェスタンブロッティング アプリケーションノート

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抗体の再利用:SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムを用いた抗体の回収および再利用

再利用の可能性を考慮して一次抗体を回収すれば、ウェスタンブロッティング実験に大変有用であると考えられます。ここでは、推奨プロトコールに従いインキュベーションステップを実施した後に、一次抗体の90%以上が回収できることをご紹介します。SNAP i.d. 2.0システム内に収集された抗体は、長時間インキュベーションした後でもブロット品質を低下させることなく、後続する免疫検出で問題なく利用可能です。

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Antibody Recovery and Reuse With theSNAP i.d.® Protein Detection System
SNAP i.d. 2.0システムを用いて、新鮮な抗体および再利用抗体でプローブした細胞抽出液ブロットの比較。ブロットは、新たに希釈した抗-PP2AまたはSNAP i.d. 2.0システムの拡張プロトコールに従い回収、再利用した抗-PP2Aでプローブされました。クリックして画像を拡大。


トリプルウェルブロット法:SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムによる30分間ウェスタンブロッティング最適化のためのツールとして用いられるトリプルウェルブロットホルダー

トリプルウェルブロット法:抗体濃度の最適化は、免疫検出の成否に関わる重要な要求項目です。抗体の結合活性/親和性は広範囲にわたるので、抗体メーカーは、新規抗体を初めて使用する際には、常に最適化するように推奨しています。これは、規定された実験範囲において免疫検出が相関性の範囲内にあることを確認し、非特異的バックグラウンドシグナルのほとんどまたはまったくない、文献レベルの品質を有するウェスタンブロットが繰り返し得られるようにすることを目的としています。

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Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Protein-Detection/western-blotting/western-blotting/13.gif
ヒト表皮腫癌(A431)細胞から調製された全細胞抽出液(レーン1~3:20、10および5μg/レーン)のブロットを、ここに示すとおり 1:100~1:500 に希釈した上皮成長因子受容体に特異的なモノクロナール抗体を用いてプローブし、これを繰り返し実施しました。HRP-標識ヤギ抗マウス二次抗体を1:10,000 の希釈倍率で用いました。クリックして画像を拡大。

免疫検出法:SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムを用いた免疫検出を成功させる重要なステップ

トリプルウェルブロット法:SNAP i.d. タンパク質免疫検出装置による30分間ウェスタンブロット最適化のためのツールとして用いられるトリプルウェルブロットホルダー トリプルウェルブロット法:抗体濃度の最適化は、免疫検出の成否に関わる重要な要求項目です。抗体の結合活性/親和性は広範囲にわたるので、抗体メーカーは、新規抗体を初めて使用する際には、常に最適化するように推奨しています。これは、規定された実験範囲において免疫検出が相関性の範囲内にあることを確認し、非特異的バックグラウンドシグナルのほとんどまたはまったくない、文献レベルの品質を有するウェスタンブロットが繰り返し得られるようにすることを目的としています。

ウェスタンブロットは、タンパク質の事前精製無しに、タンパク質の相対的濃度を検出・比較するタンパク質研究でよく用いられている強力なツールです。広く支持されている理由は、メンブレン転写前にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)でタンパク質を分離する高い分離能に加え、全体的にシンプルな点です。

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SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムを用いた免疫検出を成功させる重要なステップ
SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムは、免疫検出(ブロッキング/洗浄/抗体のインキュベーション)に必要とされる時間を約30分まで短縮するために開発されました。クリックして画像を拡大。

蛍光免疫検出法:SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムを用いた蛍光免疫検出法

蛍光色素化学およびブロッティングメンブレンにおける最近の進歩は、計測装置の改善と結びついて、ウェスタンブロッティングへの蛍光検出法の応用を加速させました。SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムは、吸引の利用により、蛍光免疫検出に必要とされる時間が実質的に短縮するように開発されました。
SNAP i.d. 吸引式免疫反応システムを用いた蛍光免疫検出法
ヒト脳細胞溶解液内GAP43のCy3蛍光免疫検出。ブロットは、Fujifilm FLA_5100画像システムを用いて可視化し、R2を0.98として定量しました。クリックして画像を拡大。