Studi Perbandingan Kecepatan dan Produk dari 7 enzim DNA polimerase high fidelity

Latar Belakang

Selama kurang lebih 25 tahun sejak ditemukannya metode Polymerase Chain Reaction (PCR) oleh Dr.Kary Mullis, metode ini telah berkembang menjadi alat atau tools utama dalam laboratorium Bioteknologi dan Biologi Molekuler serta Biologi Sel. Salah satu faktor penentu dalam keberhasilan dan konsistensi hasil PCR adalah dari kualitas enzim polimerase thermostable. Novagen memiliki enzim, kit, dan reagent biokimia untuk aplikasi PCR.

Laju kesalahan yang kecil adalah faktor yang krusial dan dapat ditemukan pada portfolio produk PCR kami yaitu KOD DNA Polymerase. KOD merupakan enzim recombinant dari jenis bakteri Thermococcus kodakaraensis (strain KOD1) yang semula diduga sebagai Pyrococcus sp yang merupakan jenis arkaea hyperthermophilic yang diisolasi dari Pulau Kodakara, Jepang. Dalam sebuah studi awal guna mengkarakterisasi enzim KOD1 DNA Polymerase, peneliti menemukan bahwa enzim ini memiliki tingkat keaukaratan (fidelity) sebanding dengan Pfu DNA Polymerase, tetapi dengan kecepatan pemanjangan (Ekstensi) 5 kali lebih cepat dengan prosesifitas (bersatuan nukleotida) yaitu 10 hingga 15 kali lebih besar dibanding enzim Pfu (Takagi 1997). Untuk aplikasi kloning, enzim polimerase yang high-fidelity lebih rekomendasikan seperti KOD DNA Polymerase. Jika enzim jenis ini cepat dan dapat menghasilkan amplikon dengan hasil tinggi serta full-length maka frekuensi probabilitas dapat menghasilkan clone yang bebas error dapat signifikan meningkat.

Sejak studi pendahuluan untuk KOD DNA Polymerase, beberapa studi telah dilakukan untuk meng-optimasi komponen buffer dan parameter siklus PCR dari KOD DNA Polymerase. Peningkatan lain adalah dibuatnya enzim KOD Hot Start DNA Polymerase yang merupakan kompleks campuran antara KOD DNA Polymerase dan 2 antibodi monoklonal. Antibodi ini berfungsi menghambat aktifitas exonuclease 3’- 5’ dan enzim tersebut pada suhu ruang (Mizuguchi 1999). Gabungan fungsi ini akan memberikan spesifitas template yang tinggi dengan cara menghambat terjadinya mispriming selama setup reaksi PCR disamping menghindari degradasi primer. Pada kajian kali ini, dilaporkan hasil evaluasi tentang kecepatan dan produk hasil dari KOD Hot Start DNA Polymerase dengan buffer teroptimasi dan dibandingkan dengan 6 jenis enzim komersial yang sekelas (high fidelity).

Bahan dan Metode

Thermocycler
Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin thermocycler dari MJ Research PTC-200 dan baru saja dikalibrasi oleh produsen. Reaksi PCR dilakukan dalam PCR Strips dan selalu menggunakan enzim polimerase yang sama dalam tube yang sama pada strip.

Volume Reaksi
Dilakukan reaksi PCR dengan volume 50, 25, 20, dan 10 µl yangt telah diuji untuk menentukan volume optimal untuk hasil PCR yang konsisten (data tidak diperlihatkan). Volume 50 dan 25 per reaksi PCR memberikan hasil yang konsisten dan 25 µl volume digunakan untuk sisa eksperimen.

Template
Template DNA yang digunakan dalam eksperimen ini adalah fragment DNA manusia peyandi GSK3α (Glycogen Synthase Kinase 3α) dengan panjang 919 bp pada domain yang terletak pada Open Reading Frame. Template ini mengandung sekitar 54% basa G dan C

Desain Pimer
Primer yang digunakan dimurnikan dengan HPLC dengan desain:
Sense (35 mer):
5´-GACGACGACAAGATTTCCCAAGAAGTGGCTTACAC-3´
Antisense (41 mer):
 5´-GAGGAGAAGCCCGGTCTTAACATCGCAGTTCATCAAAGAAG-3´

Profil Siklus
7 enzim polimerase tersebut direaksikan menggunakan 4 profil siklus protokol berbeda yang direkomendasikan oleh masing-masing pabrikan.

Tabel 1. Komponen Reaksi PCR

 Tabel 2. Profil Siklus PCR yang digunakan

Hasil dan Permbahasan: Profil Siklus yang Berbeda

Setelah masing-masing PCR Mix dalam PCR strip siap, lalu dilakukan reaksi PCR dengan 4 buah siklus yang berbeda. Setelah mencapai 23, 25, 27, dan 29 siklus, lalu PCR strip diangkat dari Thermal Cycler kemudian ditempatkan pada blok es. Sebanyak 5 µl hasil amplifikasi dari masing-masing siklus tersebut lalu dilakukan assay dengan agarose gel/buffer TAE dengan konsentrasi 1.4% kemudian di staining dengan Ethidium bromida. Konsentrasi akhir kemudian ditentukan dengan pembacaan menggunakan Quant-iTTM PicoGreen® ds DNA Assay Kit (Invitrogen) dan dengan FLUOstar Plate Reader (BMG LABTECH).

Gambar 1. Hasil PCR dari 7 Enzim Polimerase Highfidelity Thermophilic Menggunakan 4 jenis Profil Siklus yang Berbeda. A) Profil Siklus A; B) Profil Siklus B; C) Profil Siklus C; D) Profile Siklus D. M = Marker; Lane 1 = KOD Hot Start; Lane 2 = KOD DNA Polymerase; Lane 3 = Platinum Pfx; Lane 4 = Pfx 50; Lane 5 = Phusion Hot Start; Lane 6 = PfuUltra II Fusion HS; Lane 7 = PrimeSTAR HS.

Dari Gambar 1 diatas terlihat bahwa hanya enzim polimerase KOD Hot Start dan KOD DNA Polymerase bekerja sangat baik pada 4 siklus profile yang berbeda yang ditunjukkan dari ketajaman pita di Gel Elektroforesis dibanding dengan enzim polimerase highfidelity yang lain. Hasil yang sempurna ini diperoleh dari karakterisasi enzim KOD yang memiliki prosentasi mutasi yang rendah serta prosesifitas yang tinggi pula.

Tabel 2. Profil Frekuensi Mutasi dan Prosesifitas dari KOD

Dengan KOD maka kita akan mendapatkan hasil yang lebih baik dengan full-length amplicon tetapi dicapai dengan jumlah siklus reaksi PCR yang lebih sedikit. Kombinasi ini membuat KOD DNA Polymerase dan KOD Hot Start DNA Polymerase menjadi pilihan utama ketika kecepatan dan keakuratan (fidelity) menjadi alasan utama.

Untuk aplikasi cloning, siklus 19 hingga 25 lebih direkomendasikan karena kemungkinan menghasilkan clone yang bebas mutasi atau kesalahan akan semakin kecil.

Gambar 2. Plot Hasil Amplifikasi dengan Jumlah Siklus yang menyatakan kecepatan enzim. Siklus 19 hingga 25 sangat direkomendasikan untuk aplikasi cloning

PCR 2-Tahap

Primer yang lebih panjang (umumnya 23 basa) dapat meningkatkan spesifitas PCR dan dikarenakan suhu annealing yang tinggi, dapat digunakan untuk aplikasi PCR 2-tahap yang menghemat waktu. Telah diujikan enzim polimerase KOD Hot Star DNA Polymerase dengan 6 enzim polimerase highfidelity untuk PCR 2-tahap (denaturasi awal pada 95°C selama 2 menit, dan 29 siklus untuk 95°C selama 20 detik; 68°C selama 40 detik). PCR 2-tahap ini diartikan sebagai PCR tanpa tahapan ekstensi/elongasi. Gambar 3 menunjukan tidak semua enzim polimerase yang diujikan menunjukan performa yang baik dengan metode PCR 2-tahap ini.

Aplikasi KOD untuk Screening

Pengujian kemampuan KOD Hot Start DNA Polymerase untuk meng-amplifikasi beberapa template DNA yang berbeda. Enzim KOD ini digunakan untuk PCR dengan 2 tahap siklus PCR untuk melakukan screening clone acak dari T7Select Human Brain cDNA Library (Cat.No.70637). Plaque di larutkan dengan 100 µl TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA) dan 5 µl eluate digunakan untuk PCR. Primer yang digunakan: sense primer 5´-ACT TCC AAG CGG ACC AGA TTA TCG C-3´ dan antisense primer 5´-AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG-3´. Reaksi dilakukan pada suhu 95°C selama 2 menit, dan 25 siklus pada suhu 95°C selama 20 detik dan 68°C selama 25 detik. Dari 50 clone yang di screening, KOD telah berhasil meng-amplifikasi 49 insert dengan panjang basa amplicon sekitar 250 hingga 1800 pasang basa.

Gambar 3. Hasil Pengujian Screening Plaque dengan PCR dari T7Select Human cDNA Library Clone. M1 = Perfect DNA Marker, 0.5 – 12 kbp. M2 = PCR Marker.

Kesimpulan

Sejumlah studi dan pengujian independent telah dilakukan dan diverifikasi pada enzim high fidelity KOD DNA Polymerase. Enzim ini memiliki frekuensi mutasi yang rendah, laju pemanjangan yang cepat dan prosesifitas tinggi yang akan menghasilkan produk PCR dengan hasil terbaik dan full-length serta dalam jumlah reaksi siklus yang lebih sedikit dibandingkan dengan enzim lain sekelasnya. Kombinasi ini menjadikan enzim polimerase KOD DNA Polymerase dan KOD Hot Start DNA Polymerase sebagai pilihan utama untuk pengerjaan rutin PCR, aplikasi cloning high troughput, dan  studi proteomics struktural

 Referensi

 Atomi, H. et al. 2004. Archaea 1, 263
 Mizuguchi, H. et al. 1999. J. Biochem. (Tokyo) 126, 762
 Nishioka, M. et al. 2001. J. Biotech. 88, 141
 Pienaar, E. et al. 2006. Comp. Biol. Chem. 30, 102
 Rual. J-F. et al. 2004. Genome Res. 14, 2128
 Takagi, M. et al. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63, 4509
 Tindall, K.R. dan Kunkel, T.A. 1988. Biochemistry 27, 6008