為什麼推薦使用Radiance產品?
Radiance™選殖和表現系統為各種PCR產品的高效定向選殖, 以及細菌、昆蟲和哺乳類細胞中的後續表現提供各種表現載體。 這種系統提供一種重組酶替代方案: 純化後使用利用具有將所有胺基酸端點載體編碼序列移除的獨特移除能力的間接選殖法(mediated cloning)。
Radiance Means LIC
專用於高效定向選殖、
蛋白質表現以及完整的融合標籤移除
LIC (接合獨立選殖, Ligation-independent Cloning) 載體套組提供快速定向選殖、不使用限制酶消化或接合反應的PCR產品(1, 2)。LIC法利用T4 DNA聚合酶的 3´ 5´核酸外切酶活性, 在載體中創造出亟具專一性的12至15個核苷酸單股突出(overhangs)以及插入基因, 以便絕大多數緩冷配對產品可由我們想要的分子所構成。 緩冷配對的LIC載體以及插入基因會直接轉型進入E. coli的勝任細胞中, 而且共價鍵會在細胞內載體和插入基因的接合處形成, 以產出環型質體。插入基因的定向選殖可以最少量的非重組基因背景達成, 而且選殖過程相當有效, 實際上使得最後所有菌落都含有我們所要的重組基因。
具有互補核酸突出的PCR產品可將合適的5'延伸進入引子中進行製造。將純化後的PCR產物在有dNTP出現的合適條件下使用合乎LIC品質規格的T4 DNA聚合酶進行處理, 以製造和載體相容且具有專一性的突出物。
Ek/LIC載體套組
內含Ek/LIC載體, 可用於pET、pRSF、pCDF、pIEx™、pBAC™或pTriEx™-4載體的選殖。LIC是設計用來移除透過Recombinant Enterokinase進行酵素切割 、來自目標蛋白質的所有載體編碼序列。Ek/LIC載體套組提供創造可和載體以及轉型E. coli勝任細胞進行緩冷配對的單股突出。每個套組所提供的試劑足以應付20次緩冷配對和轉型。套組中包含一個控制插入基因用來確認效能。
特徵:
- 定向選殖
- 無限制酵素切割或接合
- 非重組基因背景值極低, 重組基因比例高於95%
- LIC位置相同, 可用來插入多重載體 (引子或PCR產品)
- 可直接選殖進入15個表現載體中
- LIC的位址會編碼一個腸活素分裂訊號, 可移除表現蛋白質中所有的胺基酸端點融合標籤
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專門用於Ek/LIC載體插入基因的引子設, Ek/LIC載體中的Ek/LIC所在位址具有13鹼基所構成的單股插入基因的上游核苷酸突出, 以及含有14個鹼基的單股插入基因下游核苷酸突出。Ek/LIC所在位址的左側被設計用來編碼腸活素識別位址(DDDDK↓)。這項特色讓我們能夠透過腸活素裂解的方式移除所有來自表現蛋白質的載體編碼融合序列。以下序列必須加到目標基因PCR引子的5'端, 用來產生和載體相容的核苷酸突出物: 上游引子: 5'-GAC GAC GAC AAG ATX* 下游引子可以編碼一個停止密碼的位址, 或者允許通讀(rread-through)出現在碳端點標籤序列之後的載體編碼停止密碼。 * 特定插入基因序列的第一個核苷酸必須完備ATX密碼子以帶來Met (X = G)或Ile (X = A, C or T)。 |
程序所需時間
特色
需要使用的末端序列
聚合酶相容性
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沒有額外的載體編碼胺基酸
非屬原生蛋白質序列的胺基酸會對下游應用 - 例如活性分析、鍵結研究和結構測定 - 造成影響。LIC法和Novagen Ek/LIC載體設計的一個重要特色就是, 所有胺基酸終端載體編碼序列都可以在純化進行後使用重組基因腸活素移除。
只要使用一種製備好的插入基因, 就能夠選擇許多表現載體
透過設計, 製備好的插入基因會和每一種使用Novagen製備的 Ek/LIC載體相容。
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多樣化的Ek/LIC載體 Ek/LIC載體允許在以下系統中進行蛋白質表現: |
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| 細菌 | ||
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強而有力的T7lac促進子載體搭配廣受歡迎、用來增進溶解度和純化的標籤 | |
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相容的蛋白質表現載體 | |
| 昆蟲 | ||
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瞬時高水準蛋白質表現專用載體, 無須製造重組桿狀病毒 | |
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傳統的桿狀病毒轉移質體 | |
| 哺乳類多重系統 | ||
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適合在細菌、桿狀病毒和哺乳類系統中進行高水準蛋白質表現的載體 | |
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目前適合用來進行蛋白質共表現(coexpression)的方法有二種: |
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| pRSF-2 Ek/LIC和pCDF-2 Ek/LIC載體 | ||
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含有與ColE1相容的複製基因, 當這兩種載體同時插入帶有抗青黴素的pET載體建構物的相同細胞時, 允許同時表現多達三種蛋白質 | |
| LIC Duet™ Adaptors | ||
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能夠同時將二個開放讀架(open reading frames, ORFs)選殖進入專為細菌蛋白質表現所設計的所有Novagen Ek/LIC載體中 | |
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允許從單一載體中同時表現二個蛋白質; 或者使用合適的瞬時高水準表現專用複合載體, 在無需製造重組基因桿狀病毒的條件下, 最多表現六個蛋白質 | |
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相容的複合式載體
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可能的目標蛋白質數†
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相容的
宿主細胞群 |
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載體 1
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載體 2
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Vector 3
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| pET Ek/LIC (AmpR) |
pRSF-2 Ek/LIC (KanR) |
pCDF-2 Ek/LIC (SmR) |
6
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A
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| pET (AmpR) |
pRSF-2 Ek/LIC (KanR) |
pCDF-2 Ek/LIC (SmR) |
5
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A
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| pET Ek/LIC (AmpR) |
pRSF-2 Ek/LIC (KanR) |
無 |
4
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A
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| pET Ek/LIC (AmpR) |
pCDF-2 Ek/LIC (SmR) |
無 |
4
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B
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| pRSF-2 Ek/LIC (KanR) |
pCDF-2 Ek/LIC (SmR) |
無 |
4
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A
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† 假設二個目標基因係使用LIC Duet™轉接子法針對每個Ek/LIC載體選殖
‡這些菌株帶有rpsL的突變型, 能夠提供對鏈黴素的抗性, 因此必須將鏈黴素用來選擇pCDFDuet重組基因。
抗性標誌劑: AmpR, 青黴素/卡本尼西林; KanR, 卡那毒素; SmR, 鏈黴素/奇黴素
E. coli Ek/LIC載體套組
定向PCR選殖進入最強而有力的E. coli表現載體
各類pET Ek/LIC載體組合如以下所示。專門為蛋白質共表現所設計的pCDF-2和pRSF-2 Ek/LIC載體組態也示於下列。目前也提供昆蟲和哺乳類蛋白質表現專用的Ek/LIC載體。
pIEx™ Ek/LIC載體套組
定向PCR選殖進入昆蟲細胞瞬時蛋白質表現專用的載體
pIEx™-1、-2、-3和-7可作為Ek/LIC製備載體使用。Radiance™選殖和表現系統為各種PCR產品的高效定向選殖, 以及細菌、昆蟲和哺乳類細胞中的後續表現提供各種表現載體。
pBAC™ E. coli Ek/LIC載體套組
可進行高效定向選殖進入pBAC質體中的PCR產品
pBAC™ E. coli LIC載體套組是專門設計將目標基因以高效無接合的方式選殖進入E. coli中的pBAC Ek/LIC轉移質體中, 並且使用合適的引子所強化的插入基因來啟動(欲知更多關於LIC的資訊, 詳見本章先前所提及的LIC法和E. coli Ek/LIC載體套組等部份內容)。這些載體是Radiance™選殖和表現系統中的一部份, 它們為高效定向PCR產品的選殖, 以及在細菌、昆蟲或哺乳類細胞中所進行的後續表現提供各種表現載體。
