Applications de la réaction en chaîne par polymérase (PCR)
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique fondamentale et puissante de biologie moléculaire qui constitue une méthode in vitro efficace et rapide pour l’amplification enzymatique de séquences spécifiques d’ADN ou d’ARN provenant de diverses sources. Une PCR standard comprend l’ADN cible, un ensemble d’amorces oligonucléotidiques synthétiques qui encadrent la séquence d’ADN cible, une ADN polymérase thermostable (généralement la Taq polymérase) et des nucléotides. À l'aide de thermocycleurs, chaque cycle d'amplification comporte trois étapes : la dénaturation de l'ADN double brin (ADNdb) en deux brins simples distincts, l'hybridation des amorces à la séquence d'ADN cible, et l'extension, au cours de laquelle l'ADN polymérase prolonge l'ADN à partir des amorces, créant ainsi un nouvel ADN double brin composé d'un ancien brin et d'un nouveau brin. Les brins synthétisés au cours d’un cycle servent de matrice pour le cycle suivant, ce qui permet de multiplier par un million la quantité d’ADN en seulement 20 cycles.
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PCR par transcriptase inverse (RT-PCR)
La RT-PCR, ou PCR par transcriptase inverse, est une variante de la technique PCR standard qui permet l'amplification d'ARNm spécifiques obtenus à partir d'échantillons de très petite taille. Elle élimine le besoin du fastidieux processus de purification de l'ARNm requis par les techniques de clonage conventionnelles. Avec la RT-PCR, on utilise, en plus des réactifs PCR standard, une transcriptase inverse et un échantillon d'ARN. Le mélange réactionnel est chauffé à 37 °C, ce qui permet la production d’une copie d’ADNc complémentaire à partir de l’échantillon d’ARN par la transcriptase inverse. Cet ADNc s’hybride ensuite à l’une des amorces, ce qui conduit à la synthèse du premier brin. La PCR standard se poursuit ensuite, aboutissant finalement à la production d’ADN double brin. La RT-PCR est souvent associée à la PCR en temps réel (qPCR), largement utilisée pour la quantification des niveaux de transcrits dans les cellules et les tissus.
PCR « Hot Start »
La PCR «Hot Start» est une technologie qui inhibe l’activité de la Taq polymérase en mode «Hot Start» ou l’incorporation de dNTP modifiés pendant la mise en place de la réaction, jusqu’à ce qu’une étape d’activation thermique ait lieu. Diverses méthodes permettent d’inhiber l’activité de la polymérase en mode «Hot Start», notamment les méthodes par modification chimique, par anticorps et par aptamères.
PCR en point final pour une amplification longue et précise
des cibles
La PCR en point final est souvent utilisée pour détecter la présence de cibles et déterminer leur abondance relative à la fin de la réaction. La longueur limitée des séquences produites lors d’une PCR standard, environ 5 kb, est en partie surmontée grâce à l’incorporation de facteurs supplémentaires qui assurent une activité de « correction ». La PCR longue et précise (LA) intègre l’utilisation d’une deuxième polymérase thermostable dotée d’une exonucléase 3′→5′ pour réparer les erreurs d’incorporation de nucléotides terminaux, ce qui se traduit par une fidélité considérablement accrue et la capacité d’amplifier des cibles d’ADN pouvant atteindre 40 kb de longueur.
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