Méthodes d'essai des pyrogènes

Trois types de pyrogènes sont représentés en bleu, cyan et magenta sur un fond jaune.

Les essais de pyrogénicité permettent de déterminer la quantité de pyrogènes présents dans les produits pharmaceutiques ou biopharmaceutiques administrés par voie parentérale ; ils sont régis par plusieurs normes émanant d'organismes tels que la Food and Drug Administration (FDA), la Pharmacopée des États-Unis (USP) ou la Pharmacopée européenne (EP). La stérilité d’un produit n’implique pas qu’il soit exempt de pyrogènes. Par conséquent, les médicaments censés être stériles doivent également faire l’objet d’un test de détection des pyrogènes afin de prévenir les réactions fébriles chez les patients.

Une contamination par des pyrogènes peut survenir lors de la fabrication ou de l’administration de produits pharmaceutiques, de produits biothérapeutiques et de dispositifs médicaux, mais la présence de pyrogènes peut également être une caractéristique inhérente au produit, comme c’est le cas pour les adjuvants contenus dans les vaccins ou les lipopeptides synthétiques.

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Boîte blanche ouverte portant l'étiquette « PyroMAT Kit Pyrogen Detection Assay », avec, disposés tout autour, des petits flacons, des tubes et un jeu de réactifs pour plaque à 96 puits.

Tests de pyrogénicité

Garantir la sécurité : tests de pyrogénicité des produits pharmaceutiques à l'aide du test d'activation des monocytes (MAT) afin de détecter les pyrogènes endotoxiques et non endotoxiques.

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Une scène sophistiquée représentant un laboratoire de contrôle de stérilité, avec au centre un appareil numérique muni de tuyaux. Autour de celui-ci se trouvent diverses bouteilles remplies de liquide, aux teintes claires et ambrées, ainsi que des boîtes de Pétri contenant des milieux de culture bleus, rouges et transparents. Un portoir de flacons à bouchon rouge suggère la présence d'échantillons préparés ou de milieux de culture.

Consommables, milieux de culture et instruments destinés aux tests de stérilité

Instruments de laboratoire et consommables destinés aux tests de stérilité dans le cadre du contrôle de qualité microbiologique : milieux de culture pour tests de stérilité, pompes, matériel et accessoires.

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Un scientifique, équipé d'un EPI complet, observe un échantillon au microscope.

Qu'est-ce qu'un pyrogène ?

Un pyrogène est une substance qui provoque une élévation de la température (réaction fébrile) chez l'homme ou l'animal par l'activation du système immunitaire inné. Il s'agit d'un groupe hétérogène de contaminants comprenant des substances microbiennes et non microbiennes. Les pyrogènes peuvent être classés en deux groupes : les endotoxines et les pyrogènes non endotoxiques (NEP).

Les endotoxines sont des substances présentes dans les bactéries Gram-négatives. Les pyrogènes non endotoxiques sont d’autres substances microbiennes, notamment celles issues de bactéries Gram-positives, de virus, de levures et de champignons. Les substances pyrogènes non microbiennes peuvent également provenir de particules de caoutchouc, de particules microscopiques de plastique ou de composés métalliques présents dans les élastomères.

Il existe plusieurs méthodes d'essai permettant de détecter les pyrogènes. Elles peuvent être classées en fonction du type de contaminant qu'elles détectent et de la nécessité ou non d'utiliser des matériaux d'origine animale pour réaliser l'essai, comme le décrit le tableau ci-dessous :

Test
pyrogénique chez le lapin

Le test de pyrogénicité sur le lapin (RPT) consiste à mesurer l'élévation de la température corporelle des lapins après l'injection intraveineuse du produit testé. Le RPT fournit des résultats qualitatifs et sa sensibilité est assez faible. La fiabilité du test est également limitée, en raison du développement d'une tolérance aux pyrogènes chez les lapins après des injections répétées, ou du stress subi par les lapins lors de la réalisation du test.

Remarque : le test de pyrogénicité sur le lapin (RPT) est désormais interdit en Europe, et le test d’activation des monocytes (MAT) est la méthode de choix pour détecter à la fois les pyrogènes endotoxiques et non endotoxiques.

Test d’activation des monocytes

Le test d’activation des monocytes (MAT) constitue une alternative aux méthodes utilisant des animaux pour la détection des pyrogènes endotoxiques et non endotoxiques. Le test d’activation des monocytes imite la réaction immunitaire humaine en incubant des monocytes avec l’échantillon testé. En présence de pyrogènes, les monocytes sont activés et produisent des molécules inflammatoires, les cytokines, responsables de la réaction fébrile. Les cytokines sont ensuite détectées à l’aide d’un dosage immunologique (ELISA) faisant appel à des anticorps spécifiques et à une réaction enzymatique colorée.

Remarque : à compter de juillet 2025, la Commission de la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) recommande d’utiliser le test d’activation des monocytes (MAT) comme méthode privilégiée pour le dosage des endotoxines et des pyrogènes non endotoxiques. Le test des pyrogènes sur le lapin (RPT) est désormais interdit en Europe.

Lisez l’article et échangez avec nos experts pour passer au MAT, qui détecte les pyrogènes endotoxiques et non endotoxiques, et vous conformer ainsi à la tendance réglementaire.

Détection des endotoxines bactériennes (test LAL)

La méthode la plus courante pour le dosage des endotoxines est le test au lysat d’amébocytes de Limulus (test LAL) ; un dosage basé sur le lysat d’amébocytes issu du sang du crabe fer à cheval. Le lysat issu des cellules sanguines du crabe fer à cheval réagit naturellement avec les endotoxines bactériennes dans le cadre d’une réaction de coagulation. Cette méthode présente une sensibilité élevée pour la quantification des endotoxines, mais elle ne détecte pas les pyrogènes non endotoxiques.

Test au BET recombinant (r-FC, r-CR)

Le facteur C recombinant est une protéine issue du génie génétique que l’on trouve normalement dans la cascade du lysat d’amébocytes de Limulus. Dans ce test, le facteur C réagit avec l’endotoxine et se lie à un marqueur pour produire un produit final fluorescent quantifiable. Le test au facteur C recombinant repose sur le même principe que le test LAL, mais sans nécessiter de matériel d’origine animale.

Le réactif de cascade recombinant (r-CR) est un réactif multicomposant issu du génie génétique qui reconstitue la cascade de coagulation complète présente dans le lysat d’amébocytes de Limulus. Dans ce test, les protéines de la cascade — le facteur C, le facteur B et l’enzyme procoagulante — réagissent séquentiellement avec l’endotoxine pour produire un produit final quantifiable. Le test r-CR reproduit l'intégralité de la voie LAL, mais sans nécessiter de matériel d'origine animale.

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