Contrôle de stérilité

Essai de stérilité par inoculation directe

Dans le test de stérilité par inoculation directe, un petit volume d’échantillon est transféré de manière aseptique dans un milieu de culture approprié, puis incubé. Bien que simple à réaliser, cette méthode présente plusieurs limites que les laboratoires doivent prendre en compte :

• Sensibilité réduite — seuls de petits volumes d’échantillon peuvent être ensemencés, ce qui augmente le risque de ne pas détecter une contamination de faible niveau
• Interférence due à la turbidité — les produits intrinsèquement troubles ou colorés peuvent masquer la croissance microbienne lors de l’examen visuel
• Inhibition antimicrobienne — les produits dotés de propriétés antimicrobiennes doivent être neutralisés avant l'inoculation afin d'éviter les résultats faussement négatifs

Applications des tests de stérilité : des produits pharmaceutiques aux thérapies cellulaires et géniques

Les tests de stérilité constituent une exigence de contrôle qualité courante dans un large éventail de secteurs soumis aux bonnes pratiques de fabrication (BPF). Si les principes fondamentaux restent les mêmes, le choix de la méthode, le cadre réglementaire et les exigences en matière de rapidité d'obtention des résultats varient considérablement d'un segment à l'autre :

• Les produits pharmaceutiques — notamment les produits injectables, les préparations ophtalmiques et les solutions pour perfusion — représentent le plus grand volume de tests de stérilité ; ils sont régis par les normes USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 et JP <4.06>
• Produits biologiques, biosimilaires et vaccins — produits parentéraux stériles nécessitant des essais rigoureux de libération des lots conformément aux BPF
• Dispositifs médicaux — essais de stérilité adaptés au format du dispositif, utilisant des méthodes de transfert direct ou de rinçage du produit
• Thérapies cellulaires et géniques (CGT) et médicaments de thérapie innovante avancée (ATMP) — produits à durée de conservation courte ou ultra-courte, pour lesquels les méthodes microbiologiques rapides constituent souvent la seule option viable afin de prendre des décisions de mise sur le marché le jour même ou le lendemain
• Produits radiopharmaceutiques — produits dont la demi-vie se mesure en heures, pour lesquels l’incubation traditionnelle de 14 jours n’est pas envisageable et où les méthodes microbiologiques rapides (RMM) sont de plus en plus imposées
• Médecine tissulaire et régénérative — confirmation de la stérilité avant la transplantation ou l’administration »

Procédures de contrôle de stérilité  

Procédure traditionnelle conforme aux pharmacopées — filtration sur membrane

Le protocole étape par étape suivant décrit le test de stérilité par filtration sur membrane tel qu’il est réalisé conformément aux normes USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 et JP <4.06>. 

Préparation du test — Assembler le dispositif de filtration sur membrane et raccorder les tubulures à la pompe de contrôle de stérilité à l’intérieur de l’environnement contrôlé (hotte à flux laminaire ou isolateur) 

1. Rinçage et pré-humidification de la membrane/du filtre — Pré-humidifier la membrane afin d’optimiser l’efficacité de la filtration et de minimiser l’adsorption du produit sur le filtre
2. Filtration de l’échantillon — Filtrer des volumes égaux de produit dans les deux cartouches ; les micro-organismes sont retenus par la membrane
   de 0,45 µm
3. Rinçage — Éliminez les composés inhibiteurs à l’aide d’une solution de rinçage validée afin d’éviter les résultats
   faussement négatifs
4. Remplissage des milieux de culture — Remplir les dispositifs de filtration sur membrane avec les milieux
   de culture stériles SCDM (TSB) et FTM
5. Incubation — 14 jours à 32,5 °C (FTM) et 22,5 °C (SCDM). Ces températures correspondent aux valeurs médianes des plages indiquées par les pharmacopées, respectivement de 30 à 35 °C et de 20 à 25 °C, conformément aux spécifications de l’USP <71>, de la Ph. Eur. 2.6.1 et de la JP <4.06>
   
6. Examen des résultats — Contrôle visuel de la turbidité ; toute turbidité doit faire l’objet d’une enquête en raison d’un risque de contamination
   microbienne
7. Enregistrement numérique des essais — La saisie simultanée et automatique de toutes les étapes d’essai, des actions de l’opérateur et des données de l’instrument dans un dossier électronique unique et vérifiable garantit la conformité à la norme 21 CFR Partie 11, aux principes d’intégrité des données ALCOA++ et à la préparation aux inspections réglementaires

Les descriptions des étapes sont conformes aux exigences des pharmacopées USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 et JP <4.06>. L’étape 8 reflète les attentes réglementaires actuelles en matière d’intégrité des données au titre du 21 CFR Partie 11 et de l’annexe 11 de l’UE, au-delà des exigences des pharmacopées.

Flux de travail pour les tests de stérilité rapides — Bioluminescence ATP

Pour les produits à courte durée de conservation — notamment les thérapies cellulaires et géniques, les produits radiopharmaceutiques et les produits biologiques à courte durée de vie —, la période d’incubation traditionnelle de 14 jours est souvent incompatible avec les délais de mise sur le marché des produits. Les méthodes microbiologiques rapides (RMM) offrent une alternative scientifiquement validée et acceptée par les autorités réglementaires.

La bioluminescence ATP est l’une des technologies RMM les plus éprouvées pour les essais de stérilité. Elle détecte la lumière émise par les micro-organismes viables à la suite d’une réaction avec un réactif bioluminescent, permettant ainsi une détection rapide, sensible et quantitative de la contamination. Le nouveau chapitre USP <73> — « Méthodes microbiologiques basées sur la bioluminescence de l’ATP pour la détection de la contamination dans les produits à courte durée de vie » — fournit un cadre réglementaire clair pour l’adoption des RMM, qui entrera en vigueur en août 2025.

Un processus type de test rapide de stérilité par bioluminescence ATP se déroule comme suit :

1. Filtration de l’échantillon — L’échantillon est filtré à travers une membrane dédiée, qui retient les micro-organismes viables
2. Application du réactif ATP — Des réactifs de bioluminescence sont appliqués sur la membrane, ciblant les cellules viables
3. Détection et quantification automatisées — Une caméra de détection hautement sensible capte et quantifie les signaux lumineux émis par les micro-organismes viables
4. Résultats en 5 jours ou moins — Les résultats sont disponibles jusqu’à 75 % plus rapidement qu’avec la méthode traditionnelle de 14 jours prévue par la pharmacopée. Le délai réel d’obtention des résultats dépend de la méthode validée et du type de produit.
5. Dossier de test électronique — Tous les résultats sont consignés dans un dossier numérique entièrement vérifiable, conforme à la norme 21 CFR Partie 11

Ce flux de travail repose sur la technologie de bioluminescence de l’ATP telle que décrite dans la norme USP <73>. L’étape 5 reflète les exigences réglementaires actuelles en matière d’intégrité des données et de tenue de registres électroniques, conformément à la norme 21 CFR Partie 11 et à l’annexe 11 de l’UE.

Les systèmes de surveillance de la charge microbienne (RMM) utilisant la bioluminescence ATP conviennent aussi bien aux tests de stérilité qu’à la surveillance de la charge microbienne en cours de fabrication, offrant ainsi aux laboratoires une solution polyvalente, rapide et conforme tout au long du processus de fabrication.

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