Spectrométrie de masse des protéines
La spectrométrie de masse des protéines est largement utilisée pour analyser des échantillons biologiques dans le cadre de la découverte de biomarqueurs, de la recherche en protéomique et d’applications cliniques. Par rapport à d’autres techniques utilisées pour la caractérisation à grande échelle des protéines, la spectrométrie de masse est devenue un outil incontournable de la protéomique grâce à sa capacité à traiter des analyses complexes.
La spectrométrie de masse permet d’identifier et de caractériser quantitativement les protéines en fonction de leur structure, de leurs modifications post-traductionnelles et de leurs interactions.
- L’identification des protéines implique généralement une digestion chimique ou enzymatique des protéines en peptides, qui sont ensuite analysés par spectrométrie de masse et identifiés à l’aide de méthodes informatiques ou de séquençage.
- Les modifications post-traductionnelles peuvent être identifiées grâce aux variations de masse des résidus d’acides aminés. Les sites de modification peuvent être cartographiés à l’aide de méthodes de séquençage ou de calcul.
- Pour l’analyse et le profilage des glycanes, on utilise des méthodes enzymatiques ou chimiques afin de libérer les fragments glycaniques des glycoprotéines, puis on procède à la dérivatisation des glycanes libérés en vue de leur analyse par spectrométrie de masse.
- Les interactions protéiques sont déterminées par copurification par affinité d’une protéine cible spécifique avec toute protéine interagissant avec elle, ou étudiées de manière plus globale à l’aide d’une chromatographie d’exclusion stérique ou d’échange d’ions avant analyse par spectrométrie de masse.
En protéomique quantitative, les protéines ou les peptides peuvent être marqués chimiquement à l'aide d'isotopes stables, par le biais du marquage en tandem (TMT) et de la technique iTRAQ, ou par voie métabolique grâce à l'incorporation d'acides aminés marqués (SILAC). La comparaison entre l’incorporation d’isotopes lourds et légers permet une quantification relative en corrélant les intensités des pics de spectrométrie de masse avec les abondances protéiques. Pour la quantification absolue, les échantillons peuvent être enrichis en peptides synthétiques ou en étalons protéiques marqués isotopiquement en vue d’une analyse par surveillance de réactions
sélectionnées (SRM).
En spectrométrie de masse des protéines, les masses des différentes protéines et peptides sont déterminées en mesurant le rapport m/z (masse sur charge) de leurs ions en phase gazeuse. Les spectromètres de masse convertissent d’abord les molécules protéiques en ions en phase gazeuse à l’aide d’une source d’ions. Ensuite, un analyseur de masse sépare les analytes ionisés en fonction de leur rapport m/z. Un détecteur enregistre alors le nombre d’ions pour chaque valeur m/z. La MALDI et l’ionisation par électrospray (ESI) sont couramment utilisées pour ioniser les peptides ou les protéines.
Spectrométrie de masse
MALDI-TOF
La MALDI est une méthode d’ionisation qui utilise une matrice absorbant l’énergie laser pour générer des ions avec une fragmentation minimale des molécules protéiques. L’échantillon est d’abord mélangé à un matériau matriciel approprié. Ensuite, un laser pulsé irradie l’échantillon, déclenchant l’ablation et la désorption à la fois de l’échantillon et du matériau matriciel. Les molécules d’analyte sont alors ionisées par protonation ou déprotonation dans les gaz issus de l’ablation avant d’être analysées par spectrométrie de masse.
Spectrométrie de masse par ionisation
par électrospray
L’ionisation par électrospray (ESI) produit des ions à l’aide d’un électrospray dans lequel une haute tension est appliquée à l’échantillon liquide afin de créer un aérosol, générant ainsi des ions avec une fragmentation minimale des peptides et des protéines. L’ionisation par électrospray est couramment utilisée lors du couplage de la spectrométrie de masse à la chromatographie en phase liquide (LC-MS), car l’éluat de la chromatographie en phase liquide peut être acheminé directement vers un électrospray pour un traitement en tandem.
Flux de travail
Digestion et marquage
Des protéases spécifiques, telles que la trypsine, sont utilisées pour cliver les protéines en petits fragments afin de permettre leur identification, soit en comparant les spectres expérimentaux aux spectres théoriques issus de bases de données protéiques, soit en les comparant à des étalons. Pour la quantification relative, les cultures cellulaires peuvent être marquées métaboliquement à l'aide d'isotopes stables incorporés par apport d'acides aminés, ou les échantillons peuvent être marqués avec des isotopes stables par des méthodes chimiques. L'ajout de peptides synthétiques marqués isotopiquement aux échantillons permet une quantification absolue grâce à l'analyse par surveillance de réactions sélectionnées (SRM).
Étalonnage et normalisation en spectrométrie de masse des protéines
Les étalons d'étalonnage peuvent servir de témoins pour l'analyse des échantillons et être utilisés pour déterminer l'identité des protéines, la sensibilité expérimentale et l'efficacité de la digestion, ainsi que pour faciliter la séparation chromatographique et l'analyse quantitative.
Séparation chromatographique
La chromatographie permet de séparer les protéines et les peptides en échantillons plus faciles à traiter en vue de leur analyse. Étant donné que plusieurs peptides distincts peuvent présenter des masses similaires, on recourt couramment à la HPLC pour éviter l'introduction simultanée, dans le spectromètre de masse, de peptides dont les masses sont très proches, voire identiques, ce qui permet d'augmenter la plage dynamique globale des mesures.
Détection et analyse
Les protéines et les peptides sont ionisés par MALDI ou ESI avant d'être détectés et analysés. Un analyseur de masse distingue les ions en fonction de leurs valeurs m/z. Les profils de fragmentation obtenus peuvent être utilisés à des fins d'identification, et les échantillons peuvent être quantifiés de manière relative en évaluant les rapports d'intensité des pics entre des échantillons différenciés par marquage isotopique, ou quantifiés de manière absolue à l'aide d'une analyse SRM avec des étalons internes marqués.
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