HPLC de moléculas pequeñas

HPLC de moléculas
pequeñas

El análisis por HPLC de moléculas pequeñas se realiza con mayor frecuencia en modo de separación en fase inversa. Para la separación de compuestos polares, también son adecuadas la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) y la cromatografía en fase normal, siendo la HILIC el método preferido. Para la separación de compuestos iónicos, se pueden utilizar modos de separación por intercambio iónico y, en el caso de aniones o cationes inorgánicos, también se puede recurrir a la cromatografía iónica.

La columna de HPLC está rellena con partículas de sílice totalmente porosas, partículas de sílice superficialmente porosas o partículas poliméricas, o bien consta de una barra monolítica de sílice como fase estacionaria. Además, se utilizan partículas de óxido de aluminio, de circonio y de carbono. El tamaño típico de los poros del material de la fase estacionaria para la separación de moléculas pequeñas se sitúa en el intervalo de 60 Å a 160 Å. En el caso de la HPLC, el tamaño típico de las partículas de la fase estacionaria oscila entre 3 µm y 5 µm; para la UHPLC se utilizan partículas de menor tamaño, normalmente de 2 µm o menos. Se pueden incorporar diferentes selectividades (modificaciones) a la fase estacionaria. Una cadena alquílica C18 es la química de columna más utilizada en la cromatografía de fase inversa (RP). No obstante, otras modificaciones, como C30, C8, fenilo, pentafluorofenilo y una amplia gama de modificaciones más polares, así como modificaciones con propiedades de intercambio iónico o quirales, permiten la separación de casi todos los compuestos solubles en líquidos. La fase móvil para la HPLC de fase inversa (RP) suele consistir en un tampón acuoso o en agua y disolventes orgánicos miscibles con el agua, como el acetonitrilo o el metanol.

Preparación
de muestras para HPLC

Las muestras complejas y ricas en matriz, como los alimentos, las bebidas, los cosméticos, las muestras biológicas y las formulaciones farmacéuticas ricas en matriz (por ejemplo, cremas o jarabes), requieren protocolos eficaces de preparación de muestras para eliminar los componentes no deseados y extraer de forma selectiva el analito de interés. Esto resulta fundamental si se utiliza una fase estacionaria con partículas de tamaño muy pequeño, como en la UHPLC, donde se emplean partículas de 2 µm o menos. Los métodos habituales de preparación de muestras son la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida (SPE) y, en el caso de las muestras biológicas, también la precipitación de proteínas, además de la filtración. Además de la elución selectiva del compuesto objetivo y la preconcentración, el objetivo principal de la preparación de muestras es proteger la fase estacionaria de la HPLC de la obstrucción causada por la matriz de la muestra. Las columnas de HPLC basadas en sílice monolítica toleran muy bien la matriz y requieren mucha menos preparación de muestras que las columnas de partículas. 

Derivatización

En el caso de algunas moléculas, es necesaria la derivatización, ya sea antes (precolumna) o después (poscolumna) de la separación por HPLC. La derivatización convierte las moléculas en sus derivados para obtener una mayor sensibilidad o una mejor retención cromatográfica en la HPLC. Para llevar a cabo la derivatización requerida se utilizan reactivos químicos con las propiedades físicas y químicas adecuadas.