HPLC de moléculas pequeñas

HPLC de moléculas pequeñas

El análisis por HPLC de moléculas pequeñas se realiza con mayor frecuencia en el modo de separación en fase inversa. Para la separación de compuestos polares también son adecuadas la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) y la cromatografía en fase normal, siendo HILIC el método preferido. Para la separación de compuestos iónicos, también pueden utilizarse los modos de separación por intercambio iónico y, para aniones o cationes inorgánicos, la cromatografía iónica.

La columna de HPLC está empaquetada con partículas de sílice totalmente porosas, partículas de sílice superficialmente porosas, partículas poliméricas o consiste en una varilla de sílice monolítica como fase estacionaria. Además, se utilizan partículas de óxido de alúmina, de circonio y de carbono. El tamaño de poro típico del material de la fase estacionaria para la separación de moléculas pequeñas está en el rango de 60 Å - 160 Å. Para HPLC, el tamaño de partícula típico de la fase estacionaria oscila entre 3 µm y 5 µm, mientras que para UHPLC se utilizan tamaños de partícula más pequeños, normalmente de 2 µm o menos. A la fase estacionaria se le pueden acoplar diferentes selectividades de columna (modificaciones). Una cadena alquílica C18 es la química de columna más utilizada en cromatografía de fase inversa (RP). No obstante, otras modificaciones, como C30, C8, Fenilo, Pentaflourofenilo y una amplia gama de modificaciones más polares, así como modificaciones con propiedades de intercambio iónico o quirales, permiten la separación de casi todos los compuestos solubles en líquidos. La fase móvil para la RP-HPLC suele consistir en un tampón acuoso o agua y disolventes orgánicos miscibles en agua como el acetonitrilo o el metanol.

Preparación de muestras para HPLC

Las muestras complejas y ricas en matrices, como alimentos, bebidas, cosméticos, muestras biológicas y formulaciones farmacéuticas ricas en matrices (por ejemplo, crema, jarabe) requieren protocolos eficientes de preparación de muestras para eliminar componentes no deseados y extraer selectivamente el analito de interés. Esto es fundamental si se utiliza una fase estacionaria con tamaños de partícula muy pequeños, como en la UHPLC, en la que se emplean partículas de 2 µm o menos. Los métodos habituales de preparación de muestras son la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida (SPE) y, para muestras biológicas, también la precipitación de proteínas junto a la filtración. Además de la elución selectiva del compuesto objetivo y la preconcentración, el objetivo principal de la preparación de muestras es proteger la fase estacionaria de la HPLC de la obstrucción causada por la matriz de la muestra. Las columnas HPLC basadas en la sílice monolítica puede tolerar la matriz en gran medida y requiere mucha menos preparación de la muestra que las columnas de partículas. 

Derivatización

Para algunas moléculas es necesaria la derivatización, ya sea antes (precolumna) o después (poscolumna) de la separación por HPLC. La derivatización convierte las moléculas en sus derivados para mejorar la sensibilidad o la retención cromatográfica en HPLC. Los reactivos químicos, con propiedades físicas y químicas deseables, se utilizan para la derivatización requerida.

La derivatización se realiza antes o después de la separación por HPLC.