Clonación y expresión

Vectores de expresión de proteínas

Los plásmidos, o vectores de expresión de proteínas, son fragmentos circulares de ADN que contienen numerosos elementos funcionales para la clonación y la expresión de la proteína de interés. La selección del vector de expresión adecuado viene determinada, en parte, por el tipo de proteína, el organismo que la expresará y la aplicación específica y las cuestiones científicas que el investigador pretende abordar. La amplia variedad de vectores de expresión disponibles permite a los investigadores elegir qué elementos de clonación, selección de clones y expresión de proteínas son los más adecuados para su estudio. Una vez seleccionadas la secuencia génica de interés y el vector de expresión, los investigadores suelen utilizar nucleasas para cortar con precisión el vector en sitios específicos, lo que permite que la secuencia genética de interés se clone en el marco de lectura correcto y, en última instancia, se exprese en un organismo huésped. Es importante destacar que los investigadores suelen utilizar células químicamente competentes y la transformación bacteriana para alojar los plásmidos de ADN recombinante, ya que estos se mantienen estables cuando se almacenan congelados a -70 °C.

Cómo transfectar células

La transfección celular se refiere al proceso de introducir ADN, ARN o proteínas en células eucariotas. Los investigadores disponen de diversas tecnologías físicas, químicas y biológicas para llevar a cabo esta parte del flujo de trabajo de expresión de proteínas. Los investigadores suelen emplear métodos físicos, como la electroporación, o métodos químicos, entre los que se incluyen el fosfato de calcio (CaPi), la polietilenimina (PEI) y los reactivos de lipofección. Los científicos también disponen de sistemas de transducción viral, como los lentivirales, oncoretrovirales y adenovirales. Sin embargo, el uso de métodos de administración viral suele requerir medidas adicionales de contención y seguimiento por motivos de bioseguridad.

Sistemas de expresión de proteínas

Los investigadores utilizan diversos organismos para expresar la proteína de su interés. Las bacterias son muy utilizadas por los investigadores, ya que absorben eficazmente los vectores de expresión, tienen tiempos de duplicación rápidos y pueden producir grandes cantidades de proteína recombinante en condiciones óptimas. Sin embargo, dado que las bacterias son organismos procariotas, no son capaces de proporcionar las modificaciones postraduccionales que algunas proteínas requieren. Las células eucariotas, incluidas las levaduras y las líneas celulares de mamíferos, facilitan las modificaciones postraduccionales de las proteínas y también son utilizadas habitualmente por los investigadores. La elección de la mejor línea celular para la expresión de proteínas recombinantes y la estrategia de expresión proteica dependen en gran medida de las necesidades específicas de la aplicación y de las cuestiones que el científico pretenda abordar.