Protocolo PCR estándar

A continuación se presentan estos pasos en mayor detalle junto con los materiales y consejos de selección de reactivos. Se trata de un protocolo básico de PCR que utiliza la ADN polimerasa Taq.

La PCR es una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Pasos de la PCR y componentes esenciales de la PCR

La resolución de problemas de una reacción de PCR implica muchos factores. Vea esta animación para aprender cómo la selección de los componentes adecuados y las condiciones de ciclado para sus necesidades pueden ayudar a lograr resultados óptimos.

.

Encuentre protocolos adicionales para otras polimerasas o técnicas de PCR avanzadas en la sección Protocolos de nuestra Guía de tecnologías de PCR.

Aprenda más sobre la PCR estándar, incluido qué es, en nuestra Página de fundamentos de la PCR.

Reactivos: ¿Qué se necesita para la PCR?

¿Qué es la Taq Polimerasa?

Taq ADN polimerasa es una enzima termoestable derivada de la bacteria termófila Thermus aquaticus.E. coli. Es capaz de soportar repetidos calentamientos a 95 °C (como exige la técnica PCR) sin pérdida significativa de actividad. La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 94 kDa por SDS-PAGE sin actividad endonucleasa o exonucleasa detectable. Tiene actividad ADN polimerasa 5'→3' y actividad exonucleasa 5'→3'. Cada lote de Taq polimerasa de ADN se prueba para amplificación por PCR y secuenciación bicatenario. La enzima se suministra a 5 unidades/µL y viene con un tampón de reacción 10x optimizado.

Estándar Taq Polimerasa de ADN./i>ADN polimerasa

Utilice la tabla siguiente para seleccionar una mezcla adecuada de Taq ADN polimerasa para sus condiciones de reacción. Elija entre formulaciones transparentes o teñidas de rojo con y sin cloruro de magnesio (MgCl₂) o una mezcla preparada o una mezcla maestra con tampón y dNTPs.

PolimerasaTaq.

Definición de la unidad: Una unidad incorpora 10 nmol de desoxirribonucleósido trifosfato total en ADN precipitable en ácido en 30 minutos a 74 °C.

Procedimiento: Pasos de la PCR

Las condiciones óptimas para la concentración de Taq ADN polimerasa, ADN molde, cebadores y MgCl₂ dependerán del sistema que se utilice. Puede ser necesario determinar las condiciones óptimas para cada componente individual. Esto es especialmente cierto para la Taq ADN polimerasa, los parámetros de ciclado y la concentración de MgCl₂. Se recomienda valorar la enzima y el MgCl₂ para determinar la eficacia óptima.

1. Agregue los reactivos a un tubo de tamaño adecuado en el orden indicado en la tabla. (Seleccione la tabla adecuada para la configuración de la reacción: reactivo estándar o readymix.) Para un gran número de reacciones, debe prepararse una mastermix sin la plantilla y alicuotar en los tubos de reacción. Al final, la plantilla debe añadirse a los tubos apropiados.
   

Reacción PCR estándar

*Comprar tampón y Taq polimerasa juntos: D1806, D4309 o D4545

Reacción PCR Readymix

Reacción PCR Readymix.

2. Mezclar suavemente mediante vórtex y centrifugar brevemente para recoger todos los componentes en el fondo del tubo.

Nota: añadir 50 µl de aceite mineral en la parte superior de cada tubo para evitar la evaporación si se utiliza un termociclador sin tapa calefactada.

3. Amplificar. Los parámetros de amplificación variarán en función de los cebadores y del termociclador utilizado. Puede ser necesario optimizar el sistema para los cebadores, la plantilla y el termociclador individuales.

Parámetros de ciclado típicos

Se recomiendan de 25 a 30 ciclos de amplificación.

Se recomiendan de 25 a 30 ciclos de amplificación.

4. El ADN amplificado puede evaluarse mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio.

      Nota: La superposición de aceite mineral puede eliminarse mediante una única extracción con cloroformo (1:1), recuperando la fase acuosa.

Reactivos para electroforesis de ácidos nucleicos

• Agarosa (geles prefabricados, polvo, etc.)
• Tampón como MOPS-EDTA-acetato de sodio, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Solución de carga del gel y tampón de carga de la muestra.Solución de carga de gel y tampón de carga de muestras para ARN
• Tinte o colorante de electroforesis como bromuro de etidio

Declaración de licencia

NOTA AL COMPRADOR: RENUNCIA A LA LICENCIA

Con la compra de este producto no se concede licencia alguna en virtud de ninguna de las patentes US Nos. 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787, y 6,258,569, y las patentes correspondientes fuera de los Estados Unidos, o cualquier otra patente o solicitud de patente, relacionada con los procesos de nucleasa 5' y colorante de unión a dsADN. Para más información, póngase en contacto con el Director de Licencias, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE.UU.