Solución de problemas de contaminación en cultivos celulares
Perspectiva general
Tipos de contaminación
Causas comunes y prevención de la contaminación
Microbianos (bacterias, hongos, levaduras)
Micoplasma
Contaminación viral
Contaminación química
Consejos y técnicas generales
Trabajar en la Cabina de Seguridad Biológica
Mezcla y prevención de aerosoles
Desinfección
Cómo realizar la monitorización rutinaria de células sanas
Contaminación de cultivos: Una visión general
Aunque la "contaminación de cultivos celulares" evoca típicamente pensamientos de bacterias entre las células y medios turbios, los invasores no deseados en el matraz de cultivo pueden tomar muchas formas. Los contaminantes virales y químicos también pueden tener consecuencias considerables para la salud de los cultivos, y garantizar que las líneas celulares no sufran contaminación cruzada es fundamental para la reproducibilidad de los resultados.
¿Hasta qué punto es omnipresente la contaminación celular? Según estudios de la FDA, el ATCC y otros organismos, se calcula que entre el 5 y el 30% de todos los cultivos celulares actuales están contaminados sólo con especies de micoplasma. La incidencia de la contaminación vírica de líneas celulares comunes superó el 25% en un estudio5, y es incluso más probable que los virus no citopáticos escapen a la detección que los micoplasmas, ya que la salud de los cultivos puede no proporcionar indicios de su presencia.
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Figura 1.Contaminación celular
La clave para controlar un contaminante específico a veces está relacionada con la facilidad con la que se detecta. Los contaminantes bacterianos, fúngicos y de levadura son a menudo visibles a simple vista y pueden matar rápidamente las células en cultivo, pero una morfología sutil puede hacer que intrusos microbianos significativos como el micoplasma sean más difíciles de identificar. En comparación, los virus no pueden detectarse en absoluto mediante microscopía óptica convencional, por lo que su descubrimiento suele estar motivado por observaciones de desprendimientos inexplicables u otros signos de mala salud celular o incluso de muerte celular.
Una de las preocupaciones más importantes a las que se enfrenta la comunidad biológica en los últimos años es la contaminación o incluso la identificación errónea de las líneas celulares de investigación. Para obtener más información sobre este importante tema, haga clic aquí para comprender las causas y la prevalencia de las líneas celulares contaminadas, y cómo evaluar la integridad de la identidad de la línea celular.
La contaminación por bacterias, hongos (incluidos los mohos) y levaduras suele ser visible a simple vista en forma de turbidez de aparición rápida y cambio de color del medio de cultivo (siempre que el el medio se complementa con rojo de fenol, el indicador de pH no tóxico más común). La microscopía óptica estándar también revelará células bacterianas y estructuras fúngicas, por lo que la observación microscópica diaria de los cultivos garantizará la detección precoz de la contaminación microbiana y permitirá tomar las medidas adecuadas en cuanto se manifiesten los primeros signos. En particular, es necesario retirar rápidamente los cultivos contaminados para proteger los cultivos vecinos, así como el entorno estéril de cultivo de tejidos, incluidas las incubadoras de cultivos, los baños y la cabina de bioseguridad. Además, es necesario realizar pruebas específicas de detección de bacterias y de análisis de cultivos celulares en cultivos de células de mamíferos (testing for bacteria and fungi should be used as part of a routine and regular procedimiento de cribado de control de calidad.
Causas comunes y prevención de la contaminación microbiana
.Los micoplasmas son un género de bacterias que no poseen pared celular, por lo que no se ven afectados por los antibióticos que limitan el crecimiento bacteriano al inhibir la formación de pared celular. Su morfología flexible y el tamaño de sus células, del orden de 0,15 a 0,3 µm, les permiten escapar a los métodos habituales de filtración de cultivos celulares, que suelen utilizar filtros con poros de 0,22 µm. A diferencia de la mayoría de los demás contaminantes bacterianos, los micoplasmas no resultan evidentes en una inspección casual y son difíciles de detectar mediante microscopía óptica debido a su morfología y a su tamaño notablemente pequeño. El título de micoplasma en cultivo puede alcanzar los 108 organismos/mL sin causar turbidez del medio. No suelen matar a las células de mamífero que infectan, pero afectan significativamente a los cultivos alterando el metabolismo celular, causando aberraciones cromosómicas, ralentizando el crecimiento celular e interfiriendo en la fijación celular. En resumen, es probable que influyan drásticamente en los resultados de la mayoría de los experimentos realizados con líneas celulares afectadas.
Figura 2.Los agentes habituales de detección de ADN, como DAPI o Hoechst, revelan la presencia de micoplasma en cultivos contaminados (derecha) mediante microscopía fluorescente.
Las variadas fuentes de contaminación por micoplasma en el laboratorio pueden suponer un reto. Como ciertas especies de micoplasma se encuentran en la piel humana, pueden introducirse a través de una técnica aséptica deficiente, además de la introducción a través de suplementos contaminados como suero bovino fetal.
Los micoplasmas son altamente transmisibles entre cultivos celulares vecinos contaminados. Para el tratamiento de micoplasmas es necesario filtrar los medios y tampones con membranas que tengan poros de 0,1 µm o menos, ya que los dispositivos estándar de filtración de medios con poros de 0,22 o 0,45 µm no conseguirán excluir estos pequeños organismos.
Prevención, detección y eliminación de la contaminación por micoplasma
Una vez que el micoplasma contamina un cultivo, puede propagarse rápidamente a otras áreas del laboratorio. El cumplimiento estricto de buenas prácticas de laboratorio es clave, y las pruebas rutinarias de detección de micoplasma son muy recomendables para controlar con éxito la contaminación por micoplasma. Los tres métodos de detección más populares son cultivo de micoplasma, Método de tinción de ADN y Detección basada en PCR.Ofrecemos diversas soluciones para Detección y eliminación de micoplasmas. Es fundamental establecer una rutina de detección de micoplasmas en los cultivos aunque no se sospeche de la presencia de este contaminante en el laboratorio.
Detección y eliminación de micoplasmas.
Prevenir la contaminación microbiana: ¿son los antibióticos la respuesta? Uno en el cultivo de tejidos es el uso rutinario de antibióticos, ya sea solos o en cócteles con antifúngicos. Al igual que ocurre con los antibióticos terapéuticos prescritos por los médicos, el uso continuado o inadecuado de antibióticos puede conducir al desarrollo de cepas resistentes difíciles de erradicar y puede requerir el uso de antibióticos de última generación que pueden ser tóxicos para los cultivos celulares. Estudios recientes han suscitado preocupaciones adicionales sobre el potencial de alteración de la expresión génica en las células cultivadas en presencia de antibióticos. |
Contaminación viral
Los virus se encuentran entre los contaminantes más difíciles de detectar en los cultivos celulares.Los virus se encuentran entre los contaminantes de cultivos celulares más difíciles de detectar en cultivo, ya que requieren métodos de microscopía que serían poco prácticos para la mayoría de los laboratorios de investigación. Pueden proceder del paciente o de la fuente celular del animal huésped, y se ha demostrado que varias líneas celulares de importancia biotecnológica contienen retrovirus endógenos. Más a menudo, las células se infectan por virus presentes en materiales derivados de animales utilizados para cultivarlas. El pequeño tamaño de los virus hace que sean muy difíciles de eliminar de los medios, sueros y otras soluciones de origen biológico. Sin embargo, como la mayoría de los virus están restringidos al hospedador e incluso al tejido, esto puede limitar su capacidad de infección entre especies o tejidos. Aunque los virus pueden ser más comunes en los cultivos celulares de lo que muchos investigadores creen, pueden o no presentar un factor de confusión significativo para el cultivo celular si no inducen efectos citopáticos u otros efectos adversos en las células.
Más allá de su potencial para afectar a las células cultivadas, una preocupación importante del uso de cultivos celulares infectados viralmente es el peligro potencial para la salud que suponen para el personal de laboratorio. Siempre deben tomarse precauciones de seguridad especiales cuando se trabaje con tejidos o células de seres humanos u otros primates para evitar la posible transmisión de infecciones víricas (VIH, hepatitis B, Epstein-Barr, virus del herpes B simiesco, entre otros) de los cultivos celulares al personal de laboratorio. Se debe consultar a los responsables institucionales de seguridad medioambiental acerca de los procedimientos para trabajar con tejidos, cultivos o virus potencialmente peligrosos. Para obtener más información sobre la evaluación de riesgos para el personal de laboratorio que trabaja con cultivos celulares, haga clic aquí
Mejores prácticas para reducir la incidencia de la contaminación vírica de los cultivos celulares:
*Limite el número de fuentes biológicas (proveedores, animales) de las que se extraen las células.
*Seleccione animales/células que sean menos susceptibles a los virus.
*Obtener células de repositorios que realicen pruebas de virus y proporcionen certificación de líneas celulares libres de virus.
Contaminación química
Cualquier contaminante no vivo del cultivo celular suele clasificarse como contaminante "químico".Entre los ejemplos se incluyen radicales libres, iones metálicos, residuos de desinfectantes/detergentes o incluso endotoxinas que persisten después de que los contaminantes bacterianos anteriores ya no estén presentes.
Consejos para prevenir la contaminación química:
*Utilice siempre agua de calidad de laboratorio para preparar tampones y soluciones, y resuspender reactivos liofilizados.
*Los utensilios de laboratorio reutilizables deben enjuagarse exhaustivamente y secarse al aire; la esterilización en autoclave no tendrá ningún efecto sobre los residuos de detergente.
*Obtenga medios, suplementos y suero (FBS, FCS) exclusivamente de proveedores que proporcionen certificación de pruebas de endotoxinas.
Consejos y técnicas generales para prevenir y eliminar la contaminación
Trabajar dentro de la cabina de seguridad biológica
Al trabajar dentro de la cabina de bioseguridad, es útil recordar que el flujo de aire es clave para ayudar a mantener un entorno estéril. Tanto la rejilla de ventilación trasera como la delantera deben mantenerse despejadas en todo momento para conseguir un flujo de aire eficaz. Antes de cualquier procedimiento práctico, la cabina debe estar provista de todos los materiales necesarios para minimizar la posibilidad de transferencia de contaminantes en las mangas y manos del operador.
Deben transcurrir al menos veinte minutos después de que se inicie el flujo de aire antes de colocar los artículos que se van a utilizar en la cabina. Todos los artículos que entren en la cabina deben rociarse primero con alcohol estéril al 70% (v/v) y limpiarse con toallitas sin pelusa para evitar que el polvo y las partículas entren en la cabina. Asegúrese de que el flujo de aire esté bien establecido antes de abrir cualquier tapa o recipiente, para permitir que el flujo de aire purgue el área de trabajo de las partículas que puedan haberse introducido.
Las toallitas desechables sin pelusas deben ser utilizadas para evitar la entrada de polvo y partículas en el armario.
Figura 3.Trabajar en el armario de seguridad
Pipetas y prevención de aerosoles
Las pipetas de plástico desechables -también llamadas pipetas serológicas, disponibles en capacidades de 1-100 mL- son herramientas indispensables para el cultivo celular. Deben envasarse individualmente para garantizar su esterilidad. El cumplimiento de las siguientes directrices puede minimizar la contaminación y los riesgos de seguridad asociados al pipeteado.
- Utilice ayudas de pipeteado automáticas, con cada ayuda de pipeteado restringida para su uso en un único armario. Para evitar la contaminación, desmonte y desinfecte las piezas de ayuda de pipeteado con regularidad. Asegúrese de que los filtros de los auxiliares de pipeteado estén bien abastecidos y se cambien con regularidad.
- Utilice pipetas taponadas (taponadas en la parte superior con algodón) siempre que sea posible, especialmente cuando transfiera medio.
- Evite introducir líquido en el tapón de la pipeta. Si el tapón se moja accidentalmente, cambie el filtro de ayuda para pipetas inmediatamente.
- Evite tocar la pipeta serológica por completo desenvolviéndola parcialmente, encajando el extremo en la ayuda para pipetas y retirando después la funda de papel.
- Para evitar generar aerosoles contaminantes, no cree burbujas en el medio ni en la pipeta.
Desinfección.
Los métodos diseñados para la desinfección/descontaminación de residuos de cultivos, superficies de trabajo y equipos no sólo deben minimizar el riesgo de contaminación, sino ser seguros para el personal de laboratorio. Utilice siempre el equipo de protección individual (EPI) adecuado, como guantes y protección ocular, cuando utilice formas concentradas de desinfectantes. Los guantes elegidos deben proteger contra la sustancia que se manipula. Las tablas de los fabricantes ayudarán a identificar los mejores guantes para una tarea determinada. Los principales desinfectantes se clasifican en grupos, y sus méritos relativos pueden resumirse como sigue:
Hipoclorito sódico o lejía
- Buen desinfectante de uso general
- Activo contra virus
- Corrosivo contra metales-no debe utilizarse en superficies metálicas como centrifugadoras
- Radily inactivated by organic matter and should therefore be made fresh frequently
- Use lejía comercial para crear una solución al 10% (v/v) en líquido residual o para la desinfección de superficies
Alcohol (e.g. Etanol, Isopropanol)
- Concentraciones efectivas: 70% para el etanol, 60-70% para el isopropanol
- Eficaz contra las bacterias. El etanol es eficaz contra la mayoría de los virus, pero no contra los virus sin envoltura
- El isopropanol no es eficaz contra los virus
- Los aldehídos son irritantes, por lo que su uso debe limitarse
Deben evitarse los desinfectantes a base de fenoles, ya que no están respaldados como parte del programa de revisión de la Directiva sobre biocidas de la UE.
Cómo realizar la monitorización rutinaria de células sanas
La monitorización de cultivos celulares es una parte importante del cultivo celular diario. Este tutorial le ayudará a explicar los aspectos básicos de la monitorización de sus células, incluyendo el aspecto de un cultivo sano, la confluencia celular y las diferentes fases de crecimiento de un cultivo celular. Este vídeo también mostrará indicadores comunes de contaminación bacteriana y por micoplasma.
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Referencias
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