EN ISO 11133: Medios de cultivo microbiológicos
Agua purificada de forma centralizada frente a un sistema autónomo de purificación de agua
Descripción general de la sección
- La norma EN ISO 11133 y el control de calidad de los medios de cultivo microbiológicos
- Agua purificada centralmente frente a agua procedente de un sistema Milli-Q® IX y rendimiento de los medios de cultivo
- Fuentes de agua utilizadas para preparar medios de cultivo
- Preparación de los medios de cultivo
- Evaluación de los medios de cultivo: control de calidad físico y químico
- Pruebas de rendimiento de los medios de cultivo microbiológicos preparados
- Idoneidad del sistema de purificación de agua Milli-Q® IX para la preparación y las pruebas de rendimiento de los medios de cultivo microbiológicos
- El diseño del sistema Milli-Q® IX garantiza una agua pura de calidad constante
- Ventajas del sistema de purificación de agua Milli-Q® IX para la preparación y las pruebas de rendimiento de los medios de cultivo microbiológicos
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La norma EN ISO 11133 y el control de calidad de los medios de cultivo microbiológicos
Los análisis microbiológicos son fundamentales para garantizar la seguridad y la calidad de los alimentos. Los laboratorios que realizan estos análisis deben ofrecer resultados precisos y fiables, y cumplir los requisitos normativos, todo ello bajo la presión del tiempo. Muchos análisis y procedimientos dependen de que los medios de cultivo sean capaces de proporcionar resultados consistentes y reproducibles.
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La norma EN ISO 11133 establece el marco que garantiza la calidad de los medios de cultivo y especifica los requisitos para la preparación de dichos medios cuando se utilizan para el análisis microbiológico de alimentos, piensos y agua.1 Para cumplir con la norma, cada elemento del proceso debe satisfacer requisitos específicos.
El agua puede afectar potencialmente al rendimiento de los medios de cultivo, ya que es el componente de mayor volumen de los medios microbiológicos. El objetivo del presente estudio fue preparar medios de cultivo y evaluar su rendimiento según la norma EN ISO 11133 utilizando agua procedente de dos fuentes alternativas.
Agua purificada de forma centralizada frente a agua procedente de un sistema Milli-Q® IX y rendimiento de los medios de cultivo
Este estudio investigó si un moderno sistema de purificación de agua, el sistema de agua pura Milli-Q® IX, instalado en un laboratorio de microbiología, podría sustituir de forma ventajosa al agua purificada producida de forma centralizada y obtenida a través de un circuito de distribución a la hora de preparar y analizar medios de cultivo microbiológicos. Se incluyeron medios de cultivo sólidos y líquidos para importantes patógenos e indicadores de higiene, como Listeria, Salmonella, Escherichia coli del serogrupo O157 y coliformes, así como medios de cultivo para levaduras, mohos y bacterias del ácido láctico.
Fuentes de agua utilizadas para preparar los medios de cultivo
Cada medio se preparó por duplicado disolviendo el medio deshidratado en agua procedente de dos fuentes diferentes:
- Agua purificada disponible en el laboratorio de control de calidad: el agua purificada se producía de forma centralizada mediante una combinación de ósmosis inversa (RO), intercambio iónico y una lámpara UV bactericida, y se suministraba a través de un circuito de distribución. La conductividad del agua se mantuvo por debajo de 2 µS/cm durante todo el estudio y el nivel microbiano fue < 10² ufc/mL, tal y como exige la norma EN ISO 11133 (Tabla 1).
- Agua procedente de un sistema de purificación de agua Milli-Q® IX 7003: este sistema se instaló en el laboratorio y se conectó directamente al agua del grifo. Combinaba varias tecnologías de purificación de agua para obtener agua pura: ósmosis inversa (RO), electroionización Elix® y lámparas LED UVC bactericidas. El agua recién purificada se recogía del dispensador E-POD® del sistema, que estaba equipado con un filtro Millipak® de 0,22 µm para garantizar bajos niveles microbianos. Este sistema está validado para suministrar agua purificada con una conductividad < 0,2 µS/cm, normalmente de 0,1 µS/cm a 25 °C (equivalente a una resistividad > 5 MΩ·cm, normalmente de 10-15 MΩ·cm), y un nivel microbiano < 10² ufc/mL, y cumple los requisitos de la norma ISO 11133 (Tabla 1).
Preparación de los medios de cultivo
Se seleccionaron siete medios de cultivo deshidratados diferentes (Tabla 2) para obtener resultados representativos. Todos los medios cumplen con las normas correspondientes de la EN ISO/FDA (Manual de Análisis Bacteriológico, BAM)/USDA-FSIS/APHA, y en las pruebas de rendimiento se utilizaron otras normas y métodos. En la Tabla 3 se recogen las normas que especifican los medios y las que especifican sus respectivas pruebas de rendimiento, así como las cepas de control y los números WDCM y ATCC® (American Type Culture Collection).
Los medios se prepararon siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Concretamente, se añadió la masa requerida de medio deshidratado a 500 ml de agua purificada centralmente o de agua Milli-Q® IX. Todos los medios se disolvieron, se calentaron y, en caso necesario, se esterilizaron en autoclave según las instrucciones del fabricante.
El estudio fue realizado por el laboratorio de control de calidad de ciencias de la vida para productos microbiológicos de Merck, en Darmstadt (Alemania). El laboratorio está acreditado por la autoridad de acreditación alemana DAkkS como laboratorio de ensayo registrado con el número D-PL-15185-01-00, de conformidad con la norma DIN EN ISO/IEC 170252, para los ensayos de rendimiento de medios para microbiología según la norma DIN EN ISO 11133.
Evaluación de los medios de cultivo: control de calidad físico y químico
Los siete medios de cultivo estudiados se prepararon con agua procedente de las dos fuentes alternativas. Cada medio de cultivo preparado se evaluó mediante inspección visual para garantizar que se ajustara a las recomendaciones establecidas, por ejemplo, en cuanto a aspecto, color, homogeneidad, consistencia gelatinosa y pH.
La tabla 4 describe los parámetros físicos y las especificaciones esperadas, así como los resultados obtenidos en ambas condiciones. En todos los casos, los medios preparados con agua del sistema Milli-Q® IX cumplieron las especificaciones requeridas y dieron resultados similares a los de los medios preparados con el agua purificada producida de forma centralizada por el laboratorio de control de calidad.
Pruebas de rendimiento de los medios de cultivo microbiológicos preparados
El crecimiento y la inhibición se evaluaron mediante métodos cuantitativos o cualitativos, tal y como se describe en la norma EN ISO 11133.
- La productividad es el nivel de recuperación de un microorganismo objetivo del medio de cultivo en condiciones definidas.
- La selectividad es el grado de inhibición de un microorganismo no objetivo sobre o en un medio de cultivo selectivo en condiciones definidas.
- La especificidad es la demostración, en condiciones definidas, de que los organismos no objetivo, en caso de crecer en el medio, no presentan las mismas características visuales que los microorganismos objetivo.
1. Preparación e inoculación de bacterias, levaduras y mohos
Las cepas de control se obtuvieron de ATCC® y se seleccionaron de acuerdo con los requisitos de la norma EN ISO 11133 y/u otras normas específicas. Se diluyeron hasta alcanzar el número deseado de organismos para su inoculación, con el fin de realizar ensayos de productividad, especificidad y selectividad. La evaluación del rendimiento y la interpretación de los resultados se llevaron a cabo siguiendo las especificaciones establecidas por la norma EN ISO 11133.
2. Ensayos de rendimiento
- Métodos cuantitativos: La productividad cuantitativa para los medios de cultivo sólidos se midió mediante métodos cuantitativos, tal y como se describe en la norma EN ISO 11133.
- Métodos cualitativos: La productividad, la especificidad y la selectividad se determinaron cualitativamente utilizando los métodos descritos en la norma EN ISO 11133.
Todos los medios de cultivo preparados y sometidos a ensayo cumplieron los criterios exigidos de productividad, selectividad y especificidad, cuando procedía. Los ensayos cuantitativos de productividad cumplieron los criterios exigidos: índice de productividad (IP) ≥ 50 % para los medios selectivos e IP ≥ 70 % para los medios no selectivos. Las tablas 5 y 6 recogen los resultados obtenidos en el estudio. Las pruebas cualitativas y cuantitativas de los medios de cultivo arrojaron resultados conformes a los requisitos de la norma, tanto con el agua purificada utilizada en el laboratorio de control de calidad como con el agua suministrada por el sistema Milli-Q® IX.
Selección de una solución acuosa para la preparación de medios de cultivo
A la hora de preparar medios de cultivo, es importante seleccionar la calidad de agua adecuada, ya que el agua puede contener impurezas que afecten a la productividad de los medios o provoquen anomalías, como un pH incorrecto, un color erróneo o precipitaciones, tal y como se indica en el anexo H de la norma EN ISO 11133. Los requisitos de calidad del agua establecidos en la norma se recogen en la tabla 1. Una nota adicional de la norma indica que el agua que ha pasado por una resina de intercambio iónico (agua desmineralizada o desionizada) puede tener un contenido muy elevado de microorganismos. Por lo tanto, se recomienda no utilizar agua procedente de estas fuentes sin comprobar primero su contenido microbiano. La norma advierte de que el agua desmineralizada muy contaminada, aunque se haya esterilizado mediante filtración, puede seguir conteniendo sustancias que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos.
Idoneidad del sistema de purificación de agua Milli-Q® IX para la preparación y el ensayo de rendimiento de medios de cultivo microbiológicos
Este estudio demuestra que los medios de cultivo preparados con agua procedente de un sistema Milli-Q® IX presentan características y rendimiento equivalentes a los de los medios preparados con el agua purificada centralmente que se utiliza habitualmente en el laboratorio de control de calidad acreditado. Esto indica que el agua de este sistema puede utilizarse con confianza a la hora de preparar medios de cultivo de acuerdo con la norma EN ISO 11133. El sistema Milli-Q® puede utilizarse para preparar medios de cultivo de forma manual o en combinación con innovadores instrumentos automatizados, como el sistema ReadyStream®, que simplifica el proceso mediante la preparación y dispensación de medios de cultivo precalentados.
El agua purificada por el sistema de purificación de agua Milli-Q® IX, equipado con un filtro final de 0,22 µm, ha sido validada para suministrar agua que cumple o supera los requisitos de calidad del agua de la norma EN ISO 11133 (Tabla 1). Otras normas y métodos, como los Métodos Estándar de la Asociación Americana de Salud Pública (APHA)⁵, formulan recomendaciones específicas sobre la calidad del agua y las tecnologías de purificación, a las que el sistema Milli-Q® IX se ajusta tanto en su diseño como en su rendimiento. Tal y como se recomienda, incluye una combinación de tecnologías para producir agua pura, control de la resistividad, así como un depósito de almacenamiento equipado con irradiación UV. El sistema Milli-Q® IX suministra agua con una conductividad inferior a 0,2 µS/cm, niveles microbianos inferiores a 10² ufc/mL y libre de trazas de contaminantes que puedan inhibir el crecimiento de microorganismos, como el cloro, el amoníaco y los metales. Dado que el sistema suministra agua que cumple los requisitos de calidad del agua de la norma EN ISO 11133, contribuirá a garantizar el cumplimiento normativo del laboratorio. Sin embargo, es importante asegurarse también de que esta agua sea adecuada para la preparación de medios de cultivo microbiológicos.
El diseño del sistema Milli-Q® IX garantiza una agua pura de calidad constante
El uso de agua de calidad constante para preparar medios de cultivo es un factor importante para garantizar resultados de ensayo precisos y reproducibles. El sistema Milli-Q® IX está diseñado para producir agua pura de calidad constante y para salvaguardar la pureza del agua almacenada mediante varias características clave:
- El agua purificada por el sistema se almacena en un depósito de polietileno de alta calidad, que no libera sustancias extraíbles al agua
- El depósito está protegido contra los contaminantes atmosféricos mediante un filtro de ventilación.
- Se garantizan niveles microbianos fiablemente bajos gracias a la recirculación automática del agua pura a través de una lámpara bactericida LED UVC, así como al filtro de malla de 0,22 µm situado en el punto de suministro del sistema.
- El módulo de electrodeionización Elix® incluido en el sistema garantiza una calidad constante del agua, especialmente en lo que respecta a la conductividad⁶
El bajo nivel de sustancias extraíbles del depósito de almacenamiento, el bajo nivel microbiano en el agua, así como una conductividad del agua constantemente baja, son parámetros importantes de la calidad del agua destacados en la norma EN ISO 11133. Contar con una fuente fiable e independiente de agua recién purificada evita cualquier riesgo de cambios inesperados en la calidad del agua o la indisponibilidad puntual de agua procedente de un circuito central debido a limitaciones de fabricación o mantenimiento.
Ventajas del sistema de purificación de agua Milli-Q® IX para la preparación y el ensayo de rendimiento de medios de cultivo microbiológicos
El uso de un sistema de purificación de agua Milli-Q® IX ofrece numerosas ventajas a los laboratorios que realizan ensayos microbiológicos.
- Según la norma EN ISO 11133, la conductividad del agua (o su recíproca, la resistividad) debe comprobarse antes de su uso. El sistema de agua Milli-Q® IX permite a los usuarios medir con precisión la resistividad del agua en línea y la muestra en la interfaz del dispensador E-POD®, lo que ofrece una solución de monitorización práctica. La comprobación de los parámetros de calidad del agua es fácil de realizar a través de la pantalla táctil intuitiva, compatible con guantes.
- El dispensador E-POD® permite ahorrar tiempo y ganar en precisión, ya que el caudal se puede adaptar fácilmente a las necesidades del experimento, y la pantalla permite al usuario programar un volumen específico que se va a dispensar. Además, el dispensador aporta flexibilidad, ya que se puede utilizar sobre el fregadero o apoyarlo en su brazo para llenar recipientes más grandes.
- Se puede añadir un pedal para facilitar la dispensación en serie y dejar las manos libres al usuario.
- El mantenimiento periódico del sistema lo puede realizar fácilmente cualquier miembro del laboratorio, o bien delegarse a un técnico de servicio para garantizar que el sistema funcione de forma óptima.
- El sistema almacena todos los datos relacionados con los parámetros de calidad del agua, así como información sobre cambios de consumibles y otras actividades de mantenimiento, lo que garantiza la trazabilidad de los datos y una gestión de datos sin papel. La facilidad para recuperar los datos puede simplificar la preparación del laboratorio para las auditorías. Se dispone de un servicio en línea para almacenar toda la documentación y permitir la gestión de los contratos de servicio en línea.
- Para una mayor eficiencia, el sistema puede utilizarse como fuente directa de agua para el sistema ReadyStream®, lo que permite preparar cómodamente grandes cantidades (hasta 100 L) de medios precalentados justo donde se necesitan en tan solo 15 minutos. El agua purificada suministrada por el sistema también puede utilizarse para otras tareas, como el enjuague de material de vidrio, y para alimentar autoclaves o lavadoras de material de vidrio. Esto convierte al sistema Milli-Q® IX en una solución integral para los laboratorios de microbiología.
Los resultados de este estudio revelaron que los medios de cultivo preparados con agua procedente del sistema de purificación de agua Milli-Q® IX ofrecían un rendimiento similar al de los medios de cultivo preparados con el agua purificada centralmente que se utiliza habitualmente en el laboratorio. Este sistema de purificación de agua Milli-Q® permitió al laboratorio preparar medios que cumplían con los requisitos de la norma, al tiempo que aportaba ventajas adicionales, como facilidad de uso, comodidad, trazabilidad de los datos y autonomía. En conjunto, estas características permiten una gestión eficiente del sistema de agua, garantizan la confianza en la pureza del agua y mejoran la eficiencia del laboratorio, lo que permite a los científicos trabajar con la máxima productividad.