Dépistage des mycoplasmes dans l'industrie pharmaceutique
La contamination par les mycoplasmes est un problème très répandu et récurrent dans de nombreux systèmes de culture cellulaire utilisés dans la recherche en sciences de la vie et dans l’industrie pharmaceutique. Les mycoplasmes peuvent atteindre des titres élevés dans les milieux de culture sans présenter les signes typiques d’une contamination bactérienne, tels que la turbidité. Leurs effets sur les cellules en culture comprennent une altération du métabolisme, un ralentissement de la prolifération et des aberrations chromosomiques. En résumé, la contamination par les mycoplasmes compromet la validité des données issues des lignées cellulaires touchées ainsi que celle des résultats de la recherche en sciences de la vie. C'est pourquoi le dépistage des mycoplasmes, et par conséquent le maintien de cultures cellulaires exemptes de contamination, revêtent une importance fondamentale pour la recherche cellulaire et pour la fabrication de produits où la santé des consommateurs est une préoccupation majeure.
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Un milieu de culture microbienne est un mélange de substances qui favorise et soutient la croissance et la différenciation des micro-organismes.
Les essais de stérilité constituent un élément essentiel de la validation des produits fabriqués conformément aux BPF et présentés comme stériles.
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À propos des bactéries mycoplasmes
Les mycoplasmes comptent parmi les plus petites bactéries connues, capables de passer à travers des filtres dont la taille des pores est de 0,2 µm. Ces micro-organismes se développent en aérobiose ou dans des conditions anaérobies facultatives.
Les mycoplasmes sont soit parasitaires, soit saprophytes. Plusieurs espèces, comme M. pneumoniae, sont pathogènes et provoquent des pneumonies et d’autres troubles respiratoires chez l’homme. M. genitalium serait impliqué dans les maladies inflammatoires pelviennes. En tant que bactéries dépourvues de paroi cellulaire, les mycoplasmes ne sont pas sensibles aux pénicillines ni aux autres antibiotiques agissant sur cette structure. Pour stabiliser leurs membranes cytoplasmiques, la plupart des mycoplasmes ont besoin de stérols, qu’ils puisent dans leur environnement, généralement sous forme de cholestérol provenant de leurs hôtes animaux. De nombreuses souches de Mycoplasma sont également tolérantes à divers autres antibiotiques.
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Sources de contamination par les mycoplasmes
Les sources de contamination par les mycoplasmes en laboratoire et dans les processus de fabrication sont très difficiles à maîtriser. Certaines espèces sont présentes sur la peau humaine et peuvent être introduites dans les cultures en raison de mauvaises pratiques d’asepsie. De plus, les mycoplasmes peuvent être introduits par le biais de compléments contaminés, tels que le sérum fœtal bovin, ou, le plus souvent, par transmission à partir d’autres cultures cellulaires contaminées. Une fois qu’une culture cellulaire contient des mycoplasmes, ces micro-organismes peuvent se propager rapidement et contaminer d’autres zones du laboratoire par le biais d’aérosols et de particules générés lors de la manipulation des cultures. Le respect strict des bonnes pratiques d’asepsie en laboratoire est essentiel, et il est fortement recommandé de procéder à des tests de routine sur les cultures pour lutter efficacement contre la contamination par les mycoplasmes dans les zones de production.
Pourquoi effectuer des tests de dépistage des mycoplasmes dans l'industrie pharmaceutique ?
Les sites biopharmaceutiques qui utilisent des cellules eucaryotes pour la production de vaccins doivent tester leurs banques de cellules, leurs lots de souches virales ainsi que les lots de vaccins en vrac afin de détecter toute contamination par des mycoplasmes. Les espèces appartenant à ce genre bactérien infectent les cellules eucaryotes, perturbant leur croissance et leur métabolisme. Lorsque les mycoplasmes interfèrent avec la production de vaccins, cela peut affecter la qualité et le rendement des protéines et, plus important encore, provoquer des effets secondaires chez les patients auxquels le vaccin final est administré.
La contamination des bioréacteurs par des mycoplasmes peut entraîner des pertes importantes en temps, en matières premières et en chiffre d’affaires si elle n’est pas détectée à un stade précoce du processus de fabrication. En l’absence de protocoles de test rigoureux, la contamination par les mycoplasmes des lots de production biopharmaceutiques est extrêmement difficile à détecter, car la présence de mycoplasmes n’entraîne généralement pas de variations de pH ni de turbidité visible dans les milieux de culture. La méthode de test des mycoplasmes prévue par la pharmacopée comprend à la fois des tests de culture et des tests à l’aide de cellules indicatrices pour la détection. Si seuls deux milieux sont utilisés pour l’analyse, il est recommandé d’utiliser les milieux FREY et FRIIS en combinaison.
Méthodes de dépistage des mycoplasmes
Il est important de rechercher la présence de mycoplasmes dans les produits biopharmaceutiques, les vaccins, les cultures cellulaires et les cultures virales à différentes étapes du contrôle qualité. Les trois méthodes de dépistage les plus courantes sont les suivantes :
- La culture de mycoplasmes, qui consiste à ensemencer des milieux de culture bactériens optimisés pour les mycoplasmes avec des échantillons à analyser
- les méthodes de coloration de l’ADN, dans lesquelles les noyaux des mycoplasmes sont contre-colorés au Hoechst ou au DAPI, puis observés au microscope à fluorescence
- La PCR (réaction en chaîne par polymérase) pour amplifier l’ADN bactérien si des mycoplasmes sont présents dans l’échantillon
Procédure de détection des mycoplasmes conformément aux normes EP 2.6.7 et USP 63
* Les jours suivant l'inoculation, effectuer une repique de chaque milieu liquide en inoculant 0,2 ml sur au moins une plaque de chaque milieu solide. Répéter la procédure entre le 6e et le 8e jour, puis entre le 13e et le 15e jour, et enfin entre le 19e et le 21e jour de l'essai. Observer les milieux liquides tous les 2 ou 3 jours et, en cas de changement de couleur, procéder à une repique.
Remarque : en outre, un témoin positif et un témoin négatif par milieu solide et liquide sont requis, avec une durée d'incubation de 14 jours.
Milieux prêts à l'emploi pour la détection des mycoplasmes conformément aux pharmacopées
Nous proposons une gamme complète de milieux de culture liquides et solides prêts à l’emploi, nécessaires à la détection des mycoplasmes conformément à la Pharmacopée européenne 6.1 (2.6.7.) et à l’USP 35 (63). Ne nécessitant aucune étape de préparation supplémentaire, nos milieux de culture pour mycoplasmes prêts à l’emploi garantissent une qualité constante du produit et une traçabilité complète grâce à des certificats d’analyse spécifiques à chaque lot.
En raison de leurs composants, les milieux de culture pour mycoplasmes ont généralement une durée de conservation bien plus courte que la plupart des autres milieux de culture destinés au contrôle de qualité microbiologique. La durée de conservation de nos milieux de culture liquides et solides prêts à l’emploi Friis, Frey et Hayflick a été prolongée à 4 mois pour les plaques de gélose et à 6 mois pour les bouillons. Découvrez notre gamme complète de milieux de culture prêts à l’emploi dotés d’une durée de conservation prolongée pour faciliter les tests de dépistage des mycoplasmes.
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- Cell culture protocol for testing cell lines for mycoplasma contamination using indirect DNA staining using Hoechst 33342.
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