Eau destinée aux analyses HPLC et UHPLC
La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est une technique éprouvée et fiable qui est devenue l'outil de travail incontournable de nombreux laboratoires. Aussi robuste soit-elle, la CLHP est fortement influencée par la qualité des réactifs utilisés. L'eau est l'un des réactifs les plus importants en CLHP, car elle constitue souvent un composant majeur de la phase mobile, en particulier dans la CLHP en phase inverse. Toute impureté présente dans l'eau peut avoir une incidence directe sur les résultats de la CLHP et les performances de l'instrument.
Présentation générale de la HPLC
La HPLC est l'un des outils les plus performants de la chimie analytique. Elle permet de séparer, d'identifier et de quantifier des composés présentant une large gamme de polarité, présents dans une grande variété d'échantillons solubles dans un liquide. Cette technique est à la fois sensible et polyvalente, car elle peut être appliquée à pratiquement tous les types d'échantillons, qu'ils soient pharmaceutiques, environnementaux, cliniques, médico-légaux, alimentaires, nutraceutiques ou issus de la chimie industrielle.
Principe
En HPLC, la séparation s'effectue grâce à la répartition des analytes entre une phase stationnaire garnissant une colonne et une phase mobile liquide qui est pompée à travers la colonne. Les composants de l'échantillon interagissent différemment avec la phase stationnaire et sont séparés en fonction de leur polarité, de leur charge, de leur taille ou de leur affinité. À mesure que les molécules sortent de la colonne, elles sont détectées par un détecteur UV, un détecteur à fluorescence, un spectromètre de masse ou d'autres types de détecteurs.
Un système HPLC est composé de six modules de base reliés par des tuyaux et des raccords appropriés : le(s) réservoir(s) de solvant, la(les) pompe(s), l’injecteur, la colonne, le détecteur et le système de traitement des données (figure 1).
Figure 1.Représentation schématique d'un appareil HPLC
Chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC)
La chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) utilise des particules de phase stationnaire plus petites (< 2 µm pour l’UHPLC contre 3 à 5 µm habituellement utilisées pour la HPLC) et des pressions plus élevées (jusqu’à 1 500 bars pour l’UHPLC contre 300 à 600 bars pour la HPLC) afin d’obtenir des temps d’analyse plus courts, une sensibilité et une résolution supérieures, ainsi qu’une meilleure reproductibilité que la HPLC. De plus, l’UHPLC consomme moins de solvant par échantillon, car les temps d’équilibrage et d’analyse sont plus courts. Cette technique est la méthode de choix pour les analyses à haut débit, pour l’analyse d’échantillons complexes ou lorsque la quantité d’échantillon est limitée. Elle est également de plus en plus utilisée en chimie verte, car elle permet des séparations plus rapides et une consommation de solvant moindre par rapport à la HPLC. En raison de la pression plus élevée requise, l’UHPLC nécessite un équipement capable de supporter des pressions élevées au sein du système.
Utilisez ce calculateur de transfert de méthode HPLC pour déterminer le gain en temps d’analyse et la réduction de la consommation de solvant lors du transfert d’une méthode des conditions HPLC vers celles de l’UHPLC.
Modes de séparation par HPLC
Les séparations par HPLC peuvent être réalisées en fonction des caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon :
Chromatographie en phase normale (HPLC-PN)
En HPLC en phase normale, la phase stationnaire est polaire (par exemple, la silice) et les phases mobiles utilisées sont relativement non polaires (par exemple, l’hexane ou l’acétate d’éthyle). Ce mode classique de chromatographie est couramment utilisé pour séparer les produits naturels, les lipides, les sucres et d’autres composés polaires. Dans ce mode chromatographique, l’eau n’est généralement pas utilisée.
Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC)
La HPLC en phase inverse est l’opposé de la phase normale. Elle est plus courante que la phase normale, représentant plus de 75 % des séparations. En HPLC en phase inverse, la colonne est garnie de particules hydrophobes, par exemple de la silice liée C18. La phase mobile est constituée de n’importe quelle combinaison miscible d’eau (ou d’eau modifiée par un acide, une base ou des tampons) et d’un solvant organique tel que le méthanol ou l’acétonitrile. Cette technique est très polyvalente et largement utilisée pour séparer des composés non polaires ou modérément polaires, tels que les petites molécules médicamenteuses, les peptides, les nucléotides (fragments d’ADN/ARN), les pesticides ou les conservateurs.
Chromatographie par échange d’ions (IEX-HPLC)
La chromatographie par échange d’ions est une technique puissante utilisée pour séparer des molécules chargées en s’appuyant sur les interactions ioniques avec la phase stationnaire. La phase stationnaire peut être constituée de résines à échange cationique ou anionique qui possèdent des charges fixes et attirent les ions de charge opposée. La phase mobile est généralement une solution aqueuse ou un tampon. La séparation dépend de la force d’attraction de l’analyte par la résine, qui dépend elle-même de la charge et de la densité de charge de l’analyte.
Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)
La chromatographie d’exclusion stérique, également appelée chromatographie par perméation de gel, est une technique utilisée pour séparer les molécules en fonction de leur taille en solution. La colonne contient des billes poreuses (par exemple de l’agarose) dont la taille des pores est définie. Les molécules plus grosses ne pouvant pas pénétrer dans les pores des billes, elles parcourent une distance plus courte et atteignent le détecteur avant les molécules plus petites, qui parcourent une plus grande distance à travers les pores. Cette méthode est utilisée pour séparer des molécules telles que les protéines, les polymères, les particules virales ou les nanoparticules.
Chromatographie d’affinité
La chromatographie d’affinité est une technique très sélective utilisée pour purifier des molécules spécifiques à partir de mélanges complexes, sur la base d’interactions biologiques. Elle peut également être utilisée pour des études sur les récepteurs. La colonne contient des billes d’agarose recouvertes de ligands d’affinité spécifiques à l’analyte ou à un groupe. L’analyte reconnaît le ligand et s’y lie de manière très spécifique. Les molécules cibles sont ensuite éluées en modifiant le pH, la force ionique ou en ajoutant un ligand compétitif.
Chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC)
La HIC est utilisée pour purifier des protéines et des complexes protéiques tout en préservant leur activité biologique. Les molécules sont séparées en fonction de leur hydrophobicité. L’échantillon est introduit dans un tampon à forte teneur en sel et les molécules sont éluées en diminuant progressivement la concentration en sel. Elle sépare les analytes en fonction du degré d’interaction entre les fragments hydrophobes de l’analyte et les ligands hydrophobes de la phase stationnaire.
Impact des contaminants présents dans l'eau sur la HPLC
L'un des problèmes les plus courants en HPLC est lié à la qualité des solvants/de la phase mobile. (Découvrez des conseils et astuces dans cet article.) L'eau est souvent un composant majeur de la phase mobile en HPLC, en particulier en HPLC en phase inverse ; elle doit donc être choisie avec soin. Elle est également utilisée comme blanc, pour la préparation des échantillons et pour établir des courbes d'étalonnage.
Les contaminants présents dans l’eau peuvent affecter les analyses HPLC ou les instruments HPLC de plusieurs façons.
Composés organiques
La contamination organique de l’eau utilisée en HPLC peut affecter les séparations chromatographiques de différentes manières :
Elles peuvent provoquer des lignes de base bruitées ou instables, ou co-éluer avec les composés d’intérêt, rendant ainsi l’identification et la quantification plus difficiles. Par conséquent, la sensibilité d’une méthode de chromatographie analytique peut être réduite par la présence de composés organiques dans l’eau utilisée pour les séparations chromatographiques.
Les composés organiques peuvent s’accumuler à l’entrée de la colonne, puis s’éluer sous forme de contaminants ou de pics fantômes.
Si le niveau de contamination organique est très élevé, cela peut entraîner un décalage du temps de rétention, une déformation de la forme des pics et un étalement des pics. Cela conduirait à une perte de résolution et rendrait l’identification et la quantification difficiles. Cela affecterait également la reproductibilité des expériences.
L’accumulation de matières organiques dans la colonne peut entraîner des problèmes de transfert de masse, se traduisant par une perte de résolution et, à terme, par une durée de vie réduite de la colonne.
Pour toutes ces raisons, il est essentiel de surveiller avec précision le niveau de matières organiques dans l’eau utilisée pour les applications HPLC, ce qui peut être réalisé de manière pratique à l’aide d’un moniteur de COT ou d’un indicateur de COT.1
Particules
Les particules peuvent endommager la pompe et l’injecteur. Elles peuvent également obstruer la colonne et les frittes, provoquant une augmentation de la contre-pression. Les particules peuvent également se comporter comme une phase solide secondaire susceptible de fixer les constituants de l’échantillon.
L’effet des particules est d’autant plus important en UHPLC, en raison de la taille plus petite des particules, des volumes interstitiels plus faibles, des diamètres de colonne réduits et des débits plus élevés. Les colonnes remplies de très petites particules sont plus sensibles au colmatage prématuré par les particules que leurs homologues HPLC contenant des particules plus grosses.
Colloïdes
Les colloïdes peuvent s’adsorber de manière irréversible sur la phase stationnaire, entraînant ainsi une perte de l’efficacité de séparation initiale de la colonne.
Bactéries
Les bactéries peuvent envahir les colonnes et les frittes et libérer des sous-produits organiques (voir les effets de la contamination organique).
Ions
La contamination ionique peut également affecter les séparations chromatographiques. Une modification de la force ionique de la solution peut affecter certaines séparations, et si le contaminant ionique est constitué d’ions absorbant les UV (par exemple, les nitrates, les nitrites), il apparaîtra sous forme de pic et rendra l’analyse des données difficile.
Étude : Importance de la qualité de l’eau pour la reproductibilité des analyses UHPLC
En UHPLC, l’eau est utilisée pour la dilution des échantillons, la préparation des solutions étalons et celle de la phase mobile. L’utilisation d’une eau de mauvaise qualité en UHPLC peut avoir des effets négatifs immédiats et à long terme sur la qualité des données et les performances du système. Les contaminants organiques sont les impuretés susceptibles d’affecter le plus la qualité des chromatogrammes UHPLC ; ils peuvent provoquer l’apparition de pics fantômes, des lignes de base bruitées ou une mauvaise reproductibilité. Ils peuvent également entraîner des variations progressives du temps de rétention ou une perte de résolution.
Afin de démontrer que l’eau ultra-pure Milli-Q® est adaptée aux analyses UHPLC, un mélange de sept composés a été analysé à plusieurs reprises par élution en gradient (de 80 % d’eau / 20 % d’acétonitrile à 10 % d’eau / 90 % d’acétonitrile en 3 minutes, puis maintien en mode isocratique pendant 1 minute, puis retour aux conditions initiales).
Un système Milli-Q® pour eau pure et ultra-pure, similaire au système d’eau ultra-pure Milli-Q® IQ 7003, équipé d’un filtre final Millipak®, a été utilisé.
Sur 600 injections consécutives, des temps de rétention, des aires de pic et des formes de pic stables ont été observés, indiquant que l’eau ultrapure n’introduisait pas de contaminants organiques détectables. La figure 2 illustre cette robustesse en comparant les chromatogrammes du 1er essai et du 600e essai, qui sont pratiquement identiques.
Ces résultats confirment que l’eau ultra-pure Milli-Q® fraîchement purifiée contribue à garantir des performances UHPLC fiables et reproductibles.²
Figure 2.Chromatogrammes UHPLC d'un mélange de sept composés à 254 nm. A : premier essai ; B : 600e essai. (1 : 2-acétylfurane, 2 : acétanilide, 3 : acétophénone, 4 : propiophénone, 5 : butylparabène, 6 : benzophénone et 7 : valérophénone)
Pureté de l'eau pour la HPLC
Pour les analyses HPLC et UHPLC, il est recommandé d’utiliser de l’eau ultra-pure (type 1) fraîchement purifiée, présentant un TOC inférieur à 5 ppb, ce qui indique une faible contamination organique, une résistivité de 18,2 MΩ·cm, ce qui indique une très faible teneur en contaminants ioniques, et une filtration à 0,22 µm pour contrôler les particules et les bactéries. Le choix d’un système de purification d’eau équipé d’un moniteur ou d’un indicateur de COT intégré garantit que l’eau reste exempte de contaminants organiques susceptibles d’interférer avec l’analyse et de compromettre la précision des données.
Une gamme de solutions de purification de l'eau est disponible pour les scientifiques travaillant avec la HPLC ou l'UHPLC.