HPLC de moléculas pequeñas

HPLC de moléculas pequeñas

El análisis HPLC de moléculas pequeñas se realiza con mayor frecuencia en modo de separación de fase inversa. Para la separación de compuestos polares, también son adecuados la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) y la cromatografía de fase normal, siendo HILIC el método preferido. Para la separación de compuestos iónicos, se pueden utilizar modos de separación por intercambio iónico y, para aniones o cationes inorgánicos, también se puede utilizar la cromatografía iónica.

La columna de HPLC está rellena con partículas de sílice totalmente porosas, partículas de sílice superficialmente porosas, partículas poliméricas o consiste en una varilla de sílice monolítica como fase estacionaria. Además, se utilizan óxido de alúmina, partículas de circonio y partículas de carbono. El tamaño típico de los poros del material de la fase estacionaria para la separación de moléculas pequeñas está en el rango de 60 Å - 160 Å. Para la HPLC, el tamaño típico de las partículas de la fase estacionaria oscila entre 3 µm y 5 µm, mientras que para la UHPLC se utilizan partículas de menor tamaño, normalmente de 2 µm o menos. Se pueden añadir diferentes selectividades de columna (modificaciones) a la fase estacionaria. Una cadena alquílica C18 es la química de columna más utilizada en la cromatografía de fase inversa (RP). No obstante, otras modificaciones, como C30, C8, fenilo, pentafluorofenilo y una amplia gama de modificaciones más polares, así como modificaciones con propiedades de intercambio iónico o quirales, permiten la separación de casi todos los compuestos solubles en líquidos. La fase móvil para la RP-HPLC suele consistir en un tampón acuoso o agua y disolventes orgánicos miscibles en agua, como el acetonitrilo o el metanol.

Preparación de muestras para HPLC

Las muestras complejas y ricas en matriz, como alimentos, bebidas, cosméticos, muestras biológicas y formulaciones farmacéuticas ricas en matriz (por ejemplo, cremas, jarabes), requieren protocolos eficientes de preparación de muestras para eliminar los componentes no deseados y extraer selectivamente el analito de interés. Esto es fundamental si se utiliza una fase estacionaria con partículas de tamaño muy pequeño, como en la UHPLC, donde se utilizan partículas de 2 µm o menos. Los métodos habituales de preparación de muestras son la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida (SPE) y, en el caso de las muestras biológicas, también la precipitación de proteínas, además de la filtración. Además de la elución selectiva del compuesto objetivo y la preconcentración, el objetivo principal de la preparación de muestras es proteger la fase estacionaria de la HPLC del atasco causado por la matriz de la muestra. Las columnas de HPLC basadas en sílice monolítico pueden tolerar la matriz en gran medida y requieren mucha menos preparación de muestras que las columnas de partículas.

Derivatización

Para algunas moléculas se requiere la derivatización, ya sea antes (precolumna) o después (poscolumna) de la separación por HPLC. La derivatización convierte las moléculas en sus derivados para obtener una mejor sensibilidad o retención cromatográfica en la HPLC. Para la derivatización necesaria se utilizan reactivos químicos con las propiedades físicas y químicas deseadas.