Kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína

El kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína,  es una técnica no radiactiva precisa, rápida y sencilla para detectar y cuantificar la muerte celular apoptótica al nivel celular mediante microscopia de fluorescencia y detección cuantitativa mediante citometría de flujo en las células y los tejidos. Por tanto, el kit de detección de muerte celular in situ puede utilizarse en muchos sistemas de análisis diferentes.
Son ejemplos:

• Detección de células apoptóticas individuales en cortes de tejido congelados y fijados en formalina en investigación básica
• Determinación de la sensibilidad de las células cancerosas a la apoptosis inducida por fármacos en la investigación del cáncer
• Tipado de las células que experimentan muerte celular en poblaciones heterogéneas mediante procedimientos de tinción doble

La reacción del método TUNEL marca de preferencia las roturas de la hebra de ADN generadas durante la apoptosis. Esto permite discriminar entre apoptosis y necrosis, y entre roturas de la hebra de ADN principal inducidas por citostáticos o irradiación.

Kit para detección y cuantificación de la apoptosis al nivel celular basado en el marcaje de las roturas de la hebra de ADN (tecnología TUNEL); análisis mediante microscopia de fluorescencia o citometría de flujo.

Los métodos habitualmente utilizados para determinar la apoptosis consisten en el análisis del ADN genómico mediante electroforesis en gel de agarosa y los ensayos de fragmentación del ADN basados en la ³H-timidina y, alternativamente, la 5-bromo-2′-desoxiuridina. Los métodos consisten en separación de ADN fragmentado de bajo peso molecular del ADN no fragmentado de elevado peso molecular en una población celular dada. Por tanto, estos métodos no proporcionan información sobre el destino de una célula concreta de una población celular dada o, en particular, en cortes de tejido. Por otro lado, las células apoptóticas individuales pueden ser reconocidas microscópicamente por el aspecto característico de la condensación y la fragmentación de la cromatina nuclear, pero este método es subjetivo y está limitado a un margen temporal relativamente estrecho cuando los cambios morfológicos están en su máximo.
El signo patognomónico de la apoptosis es la degradación del ADN, que en las primeras etapas es selectiva para las regiones conectoras internucleosómicas del ADN. La escisión del ADN puede producir roturas (muescas) monocatenarias o bicatenarias del ADN. Ambos tipos de roturas pueden detectarse marcando los extremos 3′-OH terminales libres con nucleótidos modificados (por ejemplo, biotina-dUTP, DIG-dUTP, fluoresceína-dUTP) en una reacción enzimática. La enzima dexosinucleotidil transferasa terminal (TdT) cataliza la polimerización independiente de molde de los desoxirribonucleótidos al extremo 3′ del ADN monocatenario o bicatenario. Este método se ha denominado también TUNEL (del inglés TdT-mediated dUTP-X nick end labeling: marcaje del extremo de la muesca con dUTP-X mediado por la TdT). También pueden marcarse los grupos 3′-OH libres utilizando ADN polimerasas mediante el mecanismo dependiente de molde denominado traducción de muesca. Sin embargo, se considera que el método TUNEL es más sensible y rápido.

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos diagnósticos.

1 kit que contiene 2 componentes.

Disolución de trabajo: Añadir el volumen total (50 μl) de la disolución enzimática a los 450 μl remanentes de la disolución de marcaje para obtener 500 μl de la mezcla de reacción TUNEL.
Mezclar bien para equilibrar los componentes.