Colagenasa from Clostridium histolyticum

La colagenasa de Clostridium histolyticum se ha utilizado:

• en la preparación de la disolución de colagenasa para la digestión de tejidos tumorales
• como suplemento en la disolución salina tamponada con fosfato para la digestión del tejido graso mesentérico extirpado
• como suplemento en el medio Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) para la digestión de segmentos de colon
• para la digestión de tejidos endometriales
• en la preparación de la enzima A y la enzima B para la digestión de los testículos desencapsulados

La colagenasa se ha utilizado en la preparación de tejido arterial para el estudio de los productos finales de glucosilación avanzada (AGE). La enzima se ha utilizado también junto con otras proteasas para la desagregación de tumores humanos, riñón de ratón, cerebro humano, epitelio pulmonar y muchos otros tejidos. También es eficaz en los estudios de perfusión del hígado y el riñón, de digestión del páncreas y de aislamiento de hepatocitos no parenquimatosos. Se ha probado la idoneidad de esta enzima para la liberación de hepatocitos, a una concentración aproximada de 1 mg/ml, en un volumen total de 100 ml para cada hígado de rata.

Adecuada para utilizar en la preparación de suspensiones monocelulares para secuenciación.

Clostridium histolyticum produce dos clases de colagenasas. Las colagenasas clostridiales son más eficientes que las de mamíferos. Rompe en múltiples sitios de rotura dentro de la triple hélice del colágeno. Las colagenasas clostridiales participan en la invasión bacteriana en la gangrena gaseosa.

La colagenasa es activada por cuatro átomo-gramos de calcio por mol de enzima. Es inhibida por el ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetil éter) - N, N, N′,N′-tetraacético, el beta-mercaptoetanol, el glutatión, el ácido tioglicólico y la 8-hidroxiquinolina.

La liberación eficaz de las células desde los tejidos requiere la acción de las enzimas colagenasas y de la proteasa neutra. La colagenasa es activada por cuatro átomo-gramos de calcio (Ca²⁺) por mol de enzima. Se piensa que el cultivo filtrado contiene como mínimo 7 proteasas diferentes cuyos pesos moleculares oscilan entre 68 y 130 kDa. El pH óptimo se encuentra entre 6,3 y 8,8. La enzima se utiliza normalmente para digerir los componentes conectivos de las muestras de tejido para liberar las células individuales. El tratamiento con colagenasa puede hacer que mueran algunas células. Normalmente se utilizan concentraciones que van de 0,1 a 5 mg/ml para la digestión. La duración de la reacción varía de 15 minutos a varias horas y produce disociación celular satisfactoria sin causar demasiada muerte celular. Se prefiere disolución tampón de Krebs Ringer con calcio y BSA y se requiere Zn²⁺ para que haya actividad.

Las disoluciones se preparan normalmente a 1-2 mg/ml en tampón TESCA (que contiene TES 50 mM, cloruro de calcio 0,36 mM a pH 7,4 y 37°C.)
Este producto contiene también clostripaína, proteasa neutra y actividades trípticas.

Una unidad de digestión de colágeno (CDU) libera péptidos del colágeno del tendón de Aquiles bovino que equivalen en la reacción de color de la ninhidrina a 1,0 μmoles de leucina en 5 horas a pH 7,4 y 37 °C en presencia de iones calcio. Una unidad de hidrólisis FALGPA hidroliza 1,0 μmoles de furilacriloil-Leu-Gly-Pro-Ala por minuto a 25°C. Una unidad de proteasa neutra hidroliza la caseína para producir color equivalente a 1,0 μmoles de tirosina por 5 horas a pH 7,5 y 37°C. Una unidad de clostripaína hidroliza 1,0 μmoles de BAEE por minuto a pH 7,6 y 25°C en presencia de DTT.

Tal como se suministra, este producto es estable durante 6 años a -20°C. No hay pérdida de actividad FALGPA ni actividad proteasa en 30 días a 37°C, 50°C y -20°C. Las disoluciones de colagenasa cruda son estables si se congelan rápidamente en alícuotas (a 10 mg/ml) y se conservan congeladas a -20°C. Otros ciclos de congelación-descongelación dañarán la disolución. El producto retiene el 100 % de su actividad durante 7 horas si se conserva en hielo.