Ensayos de viabilidad y proliferación celular
Resumen de la sección
- Ensayos de proliferación mediante síntesis de ADN
- Ensayos de proliferación metabólica
- Ensayos de viabilidad celular luminiscente
- Ensayos de proliferación con colorantes fluorescentes
- Cultivo celular en 3D: tinción triple de células vivas, muertas y totales
- Recuento celular con azul de tripano
Introducción
Los ensayos para medir la proliferación celular, la viabilidad celular y la citotoxicidad se utilizan habitualmente para monitorizar la respuesta y el estado de las células en cultivo tras el tratamiento con diversos estímulos. La elección adecuada de un método de ensayo depende del número y el tipo de células utilizadas, así como del resultado esperado. Los ensayos de proliferación celular pueden monitorizar el número de células a lo largo del tiempo, el número de divisiones celulares, la actividad metabólica o la síntesis de ADN. El recuento celular mediante colorantes de viabilidad, como el azul de tripano o la calceína-AM, puede proporcionar tanto la tasa de proliferación como el porcentaje de células viables.
Visión general de los ensayos de viabilidad y proliferación celular
Ensayos de proliferación celular con síntesis de ADN
Ensayo de proliferación celular con BrdU
La proliferación celular puede estudiarse mediante el seguimiento de la incorporación de un radioisótopo, la [3H]-timidina, al ADN celular, seguido de una autorradiografía. Como alternativa, se puede utilizar 5-bromo-2′-desoxiuridina (ensayos con BrdU) en lugar de timidina. Las células que han incorporado BrdU a su ADN se detectan fácilmente utilizando un anticuerpo monoclonal contra el BrdU y un anticuerpo secundario conjugado con una enzima o un fluorocromo.
Figura 1.A. Células en proliferación en el ojo de un embrión de pollo en estadio E4 mediante tinción con BrdU. B. Validación del anticuerpo anti-BrdU mediante camptotecina. Al tratar las células Jurkat con camptotecina, un agente de detención del ciclo celular, las células en circulación quedan retenidas en la transición de la fase G1 a la fase S.
Ensayos de proliferación con EdU
Los ensayos de proliferación con EdU de Baseclick ofrecen un método eficaz para la detección por fluorescencia del ADN en replicación. El nucleósido modificado EdU se añade a las células vivas y se incorpora al ADN en replicación. La química «click» inducida por cobre permite la unión rápida de sondas fluorescentes al EdU. Esto proporciona una forma cuantitativa de monitorizar las células que están proliferando. Los ensayos están disponibles en diversos formatos para la obtención de imágenes microscópicas, citometría de flujo, cribado de alto rendimiento y experimentos in vivo. Se ofrecen cuatro sondas fluorescentes diferentes con picos de excitación de 488, 555, 594 y 647, lo que permite la multiplexación con otras sondas fluorescentes.
Figura 2.Los kits de proliferación celular Edu-Click incorporan EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) al ADN durante la síntesis activa del ADN y se analizan mediante un método de detección fluorescente basado en la química «click».
Ensayos de proliferación metabólica
Los ensayos que miden la actividad metabólica son adecuados para analizar la proliferación, la viabilidad y la citotoxicidad. La reducción de sales de tetrazolio, como el MTT, el XTT y el WST-1, a compuestos de formazán coloreados, o la biorreducción de la resazurina, solo se produce en células metabólicamente activas. Las células que proliferan activamente aumentan su actividad metabólica, mientras que las células expuestas a toxinas presentan una actividad reducida.
Ensayos de proliferación celular con MTT
El MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; azul de tiazolilo) es una sal de tetrazolio soluble en agua que produce una solución amarillenta cuando se prepara en medios o soluciones salinas que no contienen rojo de fenol. El MTT disuelto se convierte en formazán púrpura insoluble mediante la escisión del anillo de tetrazolio por enzimas deshidrogenasas. Este formazán insoluble en agua puede solubilizarse utilizando isopropanol u otros disolventes, y el material disuelto se mide espectrofotométricamente utilizando la absorbancia en función de la concentración del colorante convertido.
Ensayos de proliferación celular con XTT
A diferencia del MTT, el producto de la escisión del XTT es soluble en agua; por lo tanto, no se requiere una etapa de solubilización. La sal de tetrazolio XTT se escinde en formazán mediante un complejo mecanismo celular. Esta biorreducción se produce únicamente en células viables y está relacionada con la producción de NAD(P)H a través de la glucólisis. La cantidad de colorante formazán formada se correlaciona directamente con el número de células metabólicamente activas en el cultivo.
Ensayos de proliferación celular con WST-1
La sal de tetrazolio estable WST-1 se escinde en formazán soluble mediante un complejo mecanismo celular que tiene lugar principalmente en la superficie celular. Esta biorreducción depende en gran medida de la producción glucolítica de NAD(P)H en las células viables. La cantidad de colorante formazán formada se correlaciona directamente con el número de células metabólicamente activas en el cultivo.
Guía del protocolo: Ensayo WST-1 para la viabilidad y la proliferación celular. Protocolos, preguntas frecuentes y resolución de problemas
Figura 3.El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la proliferación celular basado en la actividad metabólica. Las enzimas oxidorreductasas celulares dependientes del NAD(P)H reflejan el número de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el colorante tetrazolio amarillo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a su formazán insoluble, que presenta un color púrpura.
Ensayos luminiscentes de viabilidad celular
Dado que el ATP es un indicador de células metabólicamente activas, el número de células viables puede evaluarse en función de la cantidad de ATP disponible. El ensayo de viabilidad celular con luciferasa y ATP ofrece un método homogéneo y altamente sensible para cuantificar el ATP en cultivos celulares. Este kit utiliza luciferasa de luciérnaga para oxidar la D-luciferina y, a partir de la luz resultante, evaluar la cantidad de ATP disponible en los cultivos celulares. El procedimiento de ensayo, de gran sensibilidad, consiste en una única adición del cóctel de detección de ATP directamente a las células cultivadas en un medio suplementado con suero. No es necesario lavar las células, retirar el medio ni realizar múltiples pipeteos. El kit es lo suficientemente sensible como para detectar una sola célula o 0,01 picomoles de ATP. La señal producida es lineal en un rango de seis órdenes de magnitud. Al relacionar la cantidad de ATP con el número de células viables, el ensayo tiene amplias aplicaciones, que van desde la determinación del número de células viables hasta la proliferación celular y la citotoxicidad celular.
Figura 4.Ensayo de viabilidad celular con luciferasa bioluminiscente y ATP. La luciferasa de las luciérnagas utiliza el ATP para oxidar la D-luciferina, lo que da lugar a la producción de luz; de este modo, se evalúa la cantidad de ATP disponible, que se correlaciona con el número de células y su viabilidad.
Ensayos de proliferación con colorante fluorescente
Marcaje con CFSE
El diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína N-succinimidil éster (CFSE) es una opción muy utilizada para medir el número de divisiones que experimenta una población celular. Al entrar en la célula, el CFSE es escindido por las esterasas intracelulares para formar el compuesto fluorescente, y el grupo éster succinimidílico reacciona covalentemente con las aminas primarias de las proteínas intracelulares. Tras la división, la intensidad de la fluorescencia de cada célula hija se reduce a la mitad, lo que permite detectar fácilmente el número de divisiones celulares mediante citometría de flujo. El CFSE se ha utilizado ampliamente para medir la proliferación de linfocitos, incluidas las células T.
Tinción doble de células vivas/muertas
La tinción doble de células vivas/muertas puede utilizarse para la detección simultánea por fluorescencia de células viables y muertas. La calceína-AM es un colorante altamente lipofílico y permeable a la membrana celular. Aunque la calceína-AM en sí misma no es una molécula fluorescente, la calceína generada a partir de la calceína-AM por la esterasa en una célula viable emite una intensa fluorescencia verde (λex 490 nm, λem 515 nm). Por lo tanto, la calceína-AM solo tiñe las células viables. Por el contrario, el colorante para la tinción de núcleos, el yodo de propidio, no puede atravesar la membrana de una célula viable. Llega al núcleo atravesando las zonas desorganizadas de la membrana de las células muertas y se intercala en la doble hélice del ADN para emitir una fluorescencia roja (λex 535 nm, λem 617 nm). Dado que tanto la calceína como el PI-ADN pueden excitarse con luz de 490 nm, es posible realizar un seguimiento simultáneo de las células viables y muertas con un microscopio de fluorescencia de excitación única.
Figura 5.Tinción doble de células vivas y muertas
Cultivo celular en 3D: tinción triple de células vivas, muertas y totales
El kit de imagen de viabilidad celular es un ensayo tricolor que puede utilizarse con cultivos celulares en 2D y 3D para la tinción fluorescente simultánea de células viables (calceína-AM), células muertas (yoduro de propidio/PI) y el recuento total de células (Hoechst 33342).
- La calceína-AM emite una fluorescencia verde al unirse al calcio, gracias a la actividad de la esterasa presente únicamente en las células viables y metabólicamente activas.
- El yoduro de propidio (PI) es un colorante nuclear que es rechazado por la membrana de las células vivas, pero que atraviesa la membrana dañada de las células muertas, intercalándose con el ADN para emitir una intensa fluorescencia roja.
- El Hoechst 33342 es un colorante para el ADN que presenta una baja citotoxicidad. Emite una fluorescencia azul y se utiliza como indicador del recuento celular total.
Recuento celular con azul de tripano
El azul de tripano es uno de los varios colorantes recomendados para su uso en procedimientos de exclusión de colorante destinados al recuento de células viables. Este método se basa en el principio de que las células vivas (viables) no absorben el colorante azul, mientras que las células muertas (no viables) sí lo hacen. La viabilidad celular puede calcularse utilizando la relación entre el número total de células vivas y el número total de células (vivas y muertas). La tinción también facilita la visualización de la morfología celular general.
NOTA: El azul de tripano tiene mayor afinidad por las proteínas séricas que por las proteínas celulares. Si el fondo resulta demasiado oscuro debido a la presencia de suero en la matriz, las células deben centrifugarse y resuspenderse en un medio libre de proteínas o en una solución salina antes del recuento.
