NanoFabTx™ ナノ粒子製剤
ナノ粒子DDS製剤は、自由診療で用いられる治療薬に関連する多くの課題を解決します。しかし、適切なフォーミュレーションを決定することは難しく、しばしば長時間の試行錯誤による最適化が必要となります。NanoFabTx™ドラッグデリバリー製剤プラットフォームは、用途に最も適したマイクロ粒子、ナノ粒子、またはリポソーム製剤を合成、スクリーニング、および選択するための非常に柔軟なプラットフォームです。NanoFabTx™ドラッグデリバリー製剤キットおよびlipid mixは、製剤科学者によって低分子および核酸送達用に開発および試験されており、合成を簡単にするための詳細なプロトコルが用意されています。
NANOASSEMBLR®を用いたNanoFabTx™ポリマーナノ粒子およびリポソームの合成
NanoFabTx™プラットフォームは、さまざまな合成方法で利用できるように設計されており、標準的な実験用ガラス器具を使用した従来型のナノ沈殿法、またはNanoFabTx™マイクロ流体デバイスキットによるマイクロ流体工学を用いて生成することができます。ここでは、NanoFabTx™製剤スクリーニングキットおよびlipid mixが、Precision Nanosystems Inc.（PNI）のNanoAssemblr®およびNanoAssmeblr® Ignite™マイクロ流体プラットフォームでも使用できることを実証し、NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキット（917796）を使用して、さまざまなPEG-PLGAナノ粒子を合成、最適化、スクリーニングしました。さらに、NanoFabTx™ DOTAP lipid mix（926027）を使用してmRNAを内包するリポソームを調製しました。
実施例
NanoAssemblr®を用いたNanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子の合成例
NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキット（917796）は、PEG化PLGAナノ粒子を合成するためのready-to-useナノフォーミュレーションキットです。このキットには、適切に選択された4種類のPEG化PLGAと安定剤が含まれており、薬物送達を強化するための最適な製剤材料の迅速なスクリーニングを可能にします。
NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキット：NanoAssemblr®を使用して合成した高分子ナノ粒子の直径とPDI
NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキット（917796）とNanoAssemblr®を用いて、サイズが均一（PDI：約0.06～0.09）で様々な組成のナノ粒子を作製しました。NanoFabTx™ PEG-PLG製剤スクリーニングキットは、4種類のPEG-PLGA高分子からなり、研究者のニーズに合わせて最適なものをスクリーニングおよび選択することが可能です。このように、さまざまな組成のナノ粒子を迅速かつ正確にサイズ制御した製造が可能なため、長時間の試行錯誤による最適化が不要になります。同じ流速比（1:1）とポリマー濃度（2.5 wt%）で製剤化が完了します。
NanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子の精密合成
ナノ粒子サイズは、Precision Nanosystemsソフトウェア内の合成パラメータを変化させることで制御しました。ポリマー濃度を上げると、さまざまなサイズ（48～60 nm）のナノ粒子が得られました。ポリマー濃度がナノ粒子サイズに直接影響を与える一方で、PDIは低いままであり、均一なサイズ分布であることが示唆されました。
ポリマー濃度（wt.%）：NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキットとNanoAssemblr®を用いたPEG-PLGAナノ粒子の制御された合成
流量比によるNanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子のサイズ制御
流量比（FRR：flow rate ratio）は、ナノ粒子サイズの制御に使用できるもう一つの合成パラメータです。ここでは、PNIソフトウェアの流量比を1:1から1:3および1:5に変更し、合計流量を8 mL/minに維持しました。PEG-PLGAナノ粒子サイズは、FRRの増加とともに減少しました。各FRRで生成されたナノ粒子はサイズが均一であり、低いPDIを示しています。
流量比（ポリマー：安定剤）：流量比（FRR）で制御されたNanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子の直径
NanoAssemblr®を用いたNanoFabTx™製剤の創薬初期段階から前臨床開発への移行
NanoFabTx™ DDS製剤プラットフォームは、スクリーニングから前臨床開発までの研究プロセスを支援するよう設計されています。ここでは、NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキットを、PNI社のスクリーニングおよび前臨床開発用NanoAssemblr®デバイス（NanoAssemblr®およびNanoAssemblr® Ignite™）に使用した例を示しています。
NanoAssemblr®は、サンプル必要量を最小限に抑え、使いやすく、均一なサイズのナノ粒子を迅速に生成するため、フォーミュレーションのスクリーニングに最適です。また、このマイクロ流体技術は、NanoAssemblr®プラットフォーム全体でスケールアップすることができ、将来の開発を加速させることができます。NanoAssemblr® Ignite™プラットフォームは、初期の探索段階から前臨床製剤開発まで生産を行うものです。ここでは、NanoAssemblr®およびNanoAssemblr® Ignite™装置によるNanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子の製造について比較しました。
ポリマー濃度：NanoAssemblr®およびNanoAssemblr® Ignite™を使用して合成したNanoFabTx™ PEG-PLGAナノ粒子
NanoAssemblr®とNanoAssemblr® Ignite™装置を用いて、様々なポリマー濃度でPEG-PLGAナノ粒子を調製しました。ナノ粒子径はポリマー濃度により50～175 nmの範囲で、NanoAssemblr®装置で確立した流速パラメータをNanoAssemblr® Ignite™装置に適用しました。この結果から、2つの装置で同様のサイズのナノ粒子が生成され、NanoFabTx™製剤スクリーニングキットは、初期段階のスクリーニングから前臨床開発まで容易にスケールアップできることが実証されました。
上記の結果は、NanoFabTX™プラットフォームの能力と柔軟性を示しています。NanoAssemblr®装置を使用して均一なナノ粒子を生成し、ナノ粒子サイズを精密に制御することができました。さらに、NanoFabTx™ナノ粒子の製造は、NanoAssemblr®プラットフォーム全体でスケールアップすることが可能です。
NanoAssemblr®を用いて、ルシフェラーゼレポーターmRNAをDOTAPリポソームに封入しました（下記のプロトコルを参照）。再現性のあるmRNA封入DOTAPリポソームを、所望のサイズ（約120 nm）で、約90％のカプセル化効率で調製することができました（上記図Aおよび図B）。ここでは、5:1のN/P比と3:1の流量比（FRR）を選択しましたが、mRNA/核酸と所望のリポソームサイズに応じて最適化が必要です。
ルシフェラーゼレポーターmRNA封入カチオン性DOTAPリポソーム：NanoAssemblr® Ignite™で調製したmRNA封入カチオン性DOTAPリポソーム
mRNA封入DOTAPリポソームのin vitroトランスフェクションを評価しました。mRNA封入DOTAPリポソームをHeLa細胞へ送達し、24時間後、mRNA封入リポソームと未封入のリポソームは細胞適合性を示し、細胞生存率は100%となりました（上記図C）。mRNAのトランスフェクションはルシフェラーゼ（発光）の発現で評価しました。DOTAPリポソームで送達したmRNAは標的タンパク質を発現しましたが、未処理の細胞および未封入のリポソームで処理した細胞は発現しませんでした（上記図D）。
以下に示したのは、NanoAssemblr®とNanoFabTx™ DOTAP lipid mix（926027）を用いたmRNA封入DOTAPリポソームに関するプロトコルです。このプロトコルは、特定のレポーターmRNA鎖をモデルとして最適化されています。他の治療薬や核酸を使用する場合は、追加の調整が必要な場合があります。
シグマアルドリッチでは、多様な種類のNanoFabTx™製剤スクリーニングキット、lipid mix、およびマイクロ流体デバイスキットを提供しています。NanoFabTx™プラットフォームは、薬物送達アプリケーションに最適な再現性のあるナノ粒子の製造を可能にするため、各ポリマーや脂質化合物が厳密に選択、管理され、またさまざまな調製方法で使用できるように設計されています。ナノ粒子は、標準的な実験用ガラス器具を用いた沈殿法以外に、以下で説明する一般的なプロトコルにしたがってNanoAssemblr®装置を用いて作製することが可能です。
NanoAssemblr®を用いたNanoFabTx™ポリマーナノ粒子合成の一般的なプロトコル
必要な材料、注意事項、試薬の調製、薬物の定量については、NanoFabTx™ PEG-PLGA製剤スクリーニングキット（917796）に付属のプロトコルを参照してください。
プロトコル
- システムの設定、前処理
- マイクロ流体システム装置の電源を入れ、装置に接続したPCの専用ソフトウェアを開きます。
- マイクロ流体カートリッジをマイクロ流体システムに挿入してください。
- 1本のシリンジに1 mLのアセトニトリルを入れ、もう1本のシリンジに1 mLの脱イオン水を入れます。
- カートリッジホルダを持ち上げます。
- アセトニトリル用シリンジをカートリッジ挿入部の片側に、脱イオン水用シリンジをカートリッジ挿入部のもう片側にセットします。
- カートリッジホルダを元の位置に戻します。
- サンプルチューブホルダーソケットに15 mLのチューブ2本（「Waste」と表記）をセットします。
- ソフトウェアで、以下のパラメータを設定します。
○Total Volume：2 mL
○Flow Ratio（FRR）：1:1
○Total Flow Rate（TFR）：8 mL/min
○Syringe Option：スクロールダウンタブを使用して、左右のシリンジサイズを1 mLに変更
○Start Waste：0.350 mL
○End Waste：0.050 mL - 「Go」ボタンを押し、処理が完了するまで待ちます。処理終了後、シリンジポンプは初期位置に戻ります。
- 薬剤を封入した（または未封入の）ナノ粒子の合成
- ポリマー／薬剤と安定剤の溶液の濃度を表1より選択します。
- 1 mLシリンジに薬物／ポリマー溶液を1 mL充填します
- 3 mLシリンジに安定剤溶液を3 mL充填します
- カートリッジホルダを持ち上げます。
- カートリッジ挿入部の片側に薬剤／ポリマー溶液を、もう片側に安定剤シリンジをセットします。
- カートリッジホルダを元の位置に戻します。
- サンプルチューブホルダーソケットに15 mLチューブを2本セットします。「sample」ラベルが貼られたものを右側に、「waste」ラベルが貼られたものを左側にセットします。
- ソフトウェアで、以下のパラメータを設定します。
○Total Volume：2 mL
○Flow Ratio（FRR）：1:2.5
○Total Flow Rate（TFR）：8 mL/min
○Syringe Option：スクロールダウンタブを使用して、左右のシリンジサイズを1 mLに変更
○Start Waste：0.350 mL
○End Waste：0.050 mL - 「Go」ボタンを押し、処理が完了するまで待ちます。処理終了後、シリンジポンプは初期位置に戻ります。
注意：
- カートリッジは5回以上使用しないでください
- 最初に使用してから7日以内のカートリッジのみを使用してください
- プロジェクトや異なる製剤タイプ間でカートリッジを共有しないでください
- 重要なプロジェクトには新しいカートリッジを使用してください
- 過剰の安定剤、溶剤、非カプセル化薬剤の除去
- 薬剤封入ナノ粒子懸濁液を12 kDaカットオフセルロース透析チューブ（D9777）に移し替えます。
- 脱イオン水を用いて室温で2～3時間透析します。
- 精製した薬剤封入ナノ粒子溶液をガラス製バイアルに移し、2～4℃で保存します。ナノ粒子の安定性は、内包される薬剤に依存しますが、48時間以上の保存は推奨されません。
- 薬物封入ナノ粒子径の測定
- 動的光散乱装置（DLS：Dynamic Light Scattering）や透過型電子顕微鏡（TEM：transmission electron microscopy）を用いて、精製済み薬剤封入ナノ粒子のサイズを測定します。
NanoAssemblr®を用いたNanoFabTx™ mRNAリポソーム調製のための一般的なプロトコル
その他の必要材料、注意事項、試薬の調製については、NanoFabTx™ DOTAP lipid mix（926027）に付属のプロトコルをご参照ください。
プロトコル
- マイクロ流体システムのセットアップ
- 本プロトコルは、リポソーム合成に必要なハードウェアをすべて含んだNanoAssemblr® Ignite™（PNI社型番：NIN0001）、カートリッジ（PNI社型番：NIN0061）に最適化されています。
- 試薬の準備
- 10 mg/mL DOTAP溶液の調製
○-20℃で保管していたlipid mix（50 mg）バイアルを取り出します。
○このバイアルに、ニードルシリンジを用いてエタノール5 mLを加えます。
○穏やかにボルテックスし、脂質を完全に溶解させます。最終溶液は透明であることを確認します。激しくボルテックスや振とうを行わないでください。必要であれば、60℃の湯浴で分散を速めることができます。
○使用前に0.45 µmシリンジフィルター（SLFH025）で溶液をろ過します。
注記：残ったlipid mixエタノール溶液は、-20℃で保存することで、後で使用することができます。
- mRNA溶液1 mLの調製
○mRNAサンプル（1 mg/mL）を-80℃の冷蔵庫から取り出し、氷上で融解します。
○mRNAストック溶液150 µLを遠心チューブに取りだします。
○PBSバッファ770 µLをmRNA溶液に加えて希釈します。ここではN/P比を5:1としていますが、siRNAの場合はN/P比を最適化する必要があります。
○mRNA溶液は氷上で保存し、24～48時間以内に使用します
- mRNAを封入したDOTAPナノ粒子の合成
- リポソームの調製
○装置の電源を入れ、「Quick Run」をクリックし、次のようにパラメータを設定します（BD 1mL for C and BD 1mL for R; Flow rate ratio: 3:1; Total volume: 1.2 mL; Total flow rate: 12 mL/min; Start waste: 0.150 mL; End waste: 0.050 mL）。
○装置の蓋を開け、カートリッジ用アダプタがインレットLに取り付けられていることを確認し、カートリッジパッケージをカートリッジスロットに挿入してください。
○mRNA溶液（1 mL）を1 mLシリンジに、脂質溶液（0.4 mL）を別の1 mLシリンジにそれぞれ充填します。
○2本の15 mLチューブ（「Waste」と「Sample」のラベル付き）をそれぞれWasteとSampleのチューブホルダーソケットにセットします。
○1 mLシリンジ（mRNA溶液）を注入口Cに、1 mLシリンジ（脂質溶液）を注入口Rにセットします。回転式注入ブロックを元に戻します。
○装置の蓋を閉め、「Next」をクリックし、各パラメータ、カートリッジ：NEW、蓋：CLOSED等（下図）を確認し、「Start」をクリックします。
○サンプルを採取し終わったら、シリンジとカートリッジを取り外します。
- 過剰溶媒および非カプセル化mRNAの除去
○ナノ粒子サンプルを12-14 kDa cut-off Pur-A-Lyzer™ Maxi Dialysis Kit（PURX12005）に移します。
○PBSを用いて2～3時間透析します。
○精製済みのmRNA-DOTAPナノ粒子溶液をガラスバイアルに移し、2～4℃で保存します。
- 薬剤カプセル化ナノ粒子のサイズ測定
○DLS装置を用いて、精製されたmRNAカプセル化DOTAPリポソームのサイズを測定します。
mRNA含有量の定量
Quant-it™ RiboGreen RNA Assay Kitを用いてDOTAP脂質ナノ粒子のmRNAカプセル化効率の定量に用いられる一般的な方法（概略のみ）です。注：蛍光感度は機器に依存します。蛍光シグナルが低すぎる場合は、希釈倍率を下げます。
カプセル化 mRNA の測定
o 精製 mRNA-DOTAP ナノフォーミュレーションを 1×TE バッファーで 10 倍希釈する。 o
96 ウェルマイクロプレート内で、ナノフォーミュレーション 50μl と 50μl
2% Trition を混合する。 o
室温で 15 分間インキュベートする。 o
希釈色素溶液（1×TE バッファーで 100 倍希釈）を各ウェルに 100μl 添加する。 o マイクロプレートリーダーで蛍光を測定する。 o
励起波長は 485 nm、発光波長は 528 nm とする。 o フリー mRNA ストック溶液で測定した標準曲線（mRNA-色素の蛍光
- 定量分析
○カプセル化効率とは、ミセルまたはナノ粒子内に封入可能な薬物の割合です。
カプセル化効率は次のように計算されます。
EE（％）＝ カプセル化mRNA ÷ 添加した全mRNA × 100
続きを確認するには、ログインするか、新規登録が必要です。
アカウントをお持ちではありませんか？