전체 전사체 증폭 FAQ

RNA는 표준 방법이나 키트를 사용하여 분리할 수 있습니다. 혈액, 조직 생검, 배양 세포, 고정 또는 동결 조직 등 다양한 원료에서 추출한 RNA를 사용할 수 있습니다. 동물, 식물 또는 미생물과 같은 비인간 기원 RNA도 사용할 수 있습니다.

가장 우수한 성능을 위해서는 TE 용액에서 농도 5 ng/µL 이상으로 최소 50 ng의 RNA가 있어야 하며, 5 ng 미만의 RNA를 포함하는 샘플도 사용 가능합니다. RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며 분자량이 최소 300 염기 이상이어야 합니다.

예, WTA 키트는 포르말린 고정 및 파라핀 포매 샘플을 포함한 분해된 RNA를 효과적으로 증폭합니다. 그러나 최종 산물을 적절히 증폭하기 위해서는 분해된 샘플의 경우 더 많은 시료가 필요하지만, 300 ng을 초과해서는 안 됩니다.

최적의 PCR 사이클 수는 템플릿의 양과 품질에 따라 달라질 수 있습니다. 고품질 RNA의 5 ng 라이브러리 분획의 경우 17 사이클을 권장합니다. 실시간 시스템을 사용할 경우, 최적 사이클 수는 상대 형광 단위가 일정하게 유지되는 2~3 사이클의 "플래토" 단계에서 마지막 사이클로 정의됩니다.

라이브러리 증폭 완료 후, 하류 응용에 방해가 될 수 있는 잔류 프라이머 및 뉴클레오티드를 제거하기 위해 cDNA를 정제해야 합니다. 과잉 프라이머, 뉴클레오티드 또는 중합효소와 같은 다른 반응 성분으로부터 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 증폭 산물을 정제하기 위해 Sigma-Aldrich^® GenElute PCR DNA Purification Kit (NA1020)를 권장합니다.

정제된 산물의 정량에는 1 OD = 50 µg/mL의 환산율을 적용하여 UV 흡광도(A₂₆₀)를 사용해야 합니다. PicoGreen^®은 단일 가닥 산물을 효율적으로 검출하지 못하여 DNA 수율을 과소평가하므로 정량에 사용해서는 안 됩니다. 고품질 인간 총 RNA로 생성된 라이브러리의 각 분획은 4~8 µg의 WTA 제품을 생성합니다. 전기영동 시, 이 제품은 0.8% 아가로즈 겔에서 0.2 kb~2 kb 크기의 분포를 가진 스미어로 나타납니다. 제품의 수율과 크기 분포는 샘플 RNA의 완전성과 순도에 따라 달라질 수 있습니다.

WTA 증폭은 RNA 템플릿으로부터 cDNA 라이브러리를 생성합니다. qPCR, 전통적 클로닝(TOPO TA Cloning^®), 마이크로어레이 등의 응용이 수행될 수 있습니다.

WGA2는 첫 번째 가닥 합성, 두 번째 가닥 합성 및 cDNA 라이브러리 증폭에 필요한 모든 완충액, 프라이머 및 효소를 제공합니다.

초소형 원심분리기, 피펫, 보텍서, 열순환기, 분광광도계가 필요하며, 애질런트 바이오애널라이저^®도 유용할 수 있습니다.

아니요, 본 시스템에서는 보편적 말단을 가진 준무작위 WTA 프라이머를 사용하여 cDNA 산물을 합성합니다. 이를 통해 증폭 가능한 서열의 상당 부분이 폴리-A 서열에서 분리된 고도로 분해된 RNA의 증폭이 가능합니다. 분해된 RNA와 완전한 RNA 모두에 대해 3' 편향적 방법 대비 qPCR 및 마이크로어레이 검사가 성공적으로 수행되었습니다.

WTA2 시스템은 랜덤 프라이밍을 포함하므로 프라이머는 mRNA 내 어느 위치에서나 설계할 수 있습니다. 가능한 게놈 DNA 오염으로 인한 qPCR 간섭을 피하기 위해, RNA를 DNase로 처리하고 증폭 영역이 인트론을 가로지르도록 설계할 것을 권장합니다. 시작 FFPE RNA가 심하게 분해되었을 가능성이 높으므로, 전사체 전반에 걸쳐 여러 위치에 대한 검사를 설계할 것을 강력히 권장합니다.

예, 이 프로토콜은 마이크로어레이 분석을 위한 마이크로그램 단위의 cDNA를 생성하도록 최적화되어 있습니다. 반응 용량을 줄여도 결과의 질에는 영향을 미치지 않으며, 최종 산물의 양만 달라질 뿐입니다.

cDNA 산물은 일반적인 PCR 산물과 유사합니다. TOPO TA 클로닝 방법을 권장합니다. 최적의 클로닝 결과를 얻기 위해 희석 배합을 설정하십시오.