단백질 질량 분석법

단백질 질량 분석법은 바이오마커 발굴, 프로테오믹스 연구 및 임상 응용을 위해 생물학적 시료를 분석하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 대규모 특성 분석에 사용되는 다른 기법들과 비교할 때, 질량 분석법은 복잡한 분석에 적합하다는 점에 기반하여 프로테오믹스 분야의 주요 도구로 자리 잡았습니다.

질량 분석법은 단백질의 구조, 번역 후 변형 및 상호작용을 바탕으로 단백질을 정량적으로 동정하고 특성화하는 데 사용됩니다.

단백질 동정 과정에서는 일반적으로 단백질을 화학적 또는 효소적 분해를 통해 펩타이드로 분해한 후, 이를 질량 분석법으로 분석하고 전산적 방법이나 염기서열 분석을 통해 동정합니다.
번역 후 변형은 아미노산 잔기의 질량 변화를 통해 식별할 수 있습니다. 변형 부위는 염기서열 분석이나 계산적 방법을 사용하여 매핑할 수 있습니다.
당쇄 분석 및 프로파일링의 경우, 효소적 또는 화학적 방법을 사용하여 당단백질에서 당쇄 모이어티를 분리하고, 분리된 당쇄를 질량 분석에 적합하도록 유도체화한 후 분석합니다.
단백질 상호작용은 특정 표적 단백질과 상호작용하는 단백질들을 친화성 공동 정제를 통해 확인하거나, 질량 분석법 분석에 앞서 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 보다 포괄적으로 연구할 수 있습니다.

정량적 단백질체학의 경우, 단백질이나 펩타이드는 탠덤 질량 태깅(TMT) 및 iTRAQ를 사용하여 안정 동위원소로 화학적으로 표지하거나, 표지된 아미노산의 도입(SILAC)을 통해 대사적으로 표지할 수 있습니다. 중동위원소와 경동위원소의 도입량을 비교함으로써, 질량 분석 피크 강도와 단백질 농도를 상호 연관시켜 상대적 정량화를 수행할 수 있습니다. 절대 정량화의 경우, 선택적 반응 모니터링(SRM) 분석을
위해 동위원소 표지된 합성 펩타이드 또는 단백질 표준물을 시료에 첨가할 수 있습니다.

단백질 질량 분석법에서는 기체상 이온의 m/z(질량 대 전하) 비율을 측정하여 다양한 단백질과 펩타이드의 질량을 결정합니다. 질량 분석기는 먼저 이온 소스를 사용하여 단백질 분자를 기체상 이온으로 변환합니다. 다음으로, 질량 분석기가 m/z 비율에 따라 이온화된 분석물을 분리합니다. 그런 다음 검출기가 각 m/z 값에 해당하는 이온의 수를 기록합니다. 펩타이드나 단백질을 이온화하기 위해 일반적으로 MALDI 및 전기분사 이온화(ESI)가 사용됩니다.

MALDI-TOF 질량 분석법

MALDI는 레이저 에너지를 흡수하는 매트릭스를 사용하여 단백질 분자의 단편화를 최소화하면서 이온을 생성하는 이온화 방법입니다. 시료는 먼저 적절한 매트릭스 물질과 혼합됩니다. 다음으로, 펄스 레이저가 시료에 조사되어 시료와 매트릭스 물질 모두의 절제 및 탈착을 유발합니다. 그런 다음, 분석 대상 분자들은 질량 분석에 앞서 절제된 기체 내에서 양성자화 또는 탈양성자화를 통해 이온화됩니다.

전기분사 이온화 질량 분석법

전기분무 이온화(ESI)는 액체 시료에 고전압을 가해 에어로졸을 생성하는 전기분무를 이용하여 이온을 생성하며, 펩타이드와 단백질의 단편화를 최소화하면서 이온을 생성합니다. 전기분무 이온화는 액체 크로마토그래피 용출물을 전기분무 장치로 직접 공급하여 탠덤 처리를 수행할 수 있기 때문에, 액체 크로마토그래피와 질량 분석법을 결합한 LC-MS에서 일반적으로 사용됩니다.

워크플로우

단백질 시료 전처리

질량 분석법을 위한 단백질 시료 전처리 과정에는 세포 용해 또는 단백질의 용해 및 안정화 단계가 필요합니다. 프로테오믹스 분석을 위해, 단백질 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제가 포함된 완충액을 사용하여 세포막을 파괴함으로써 세포를 용해시킵니다. 필요에 따라 고농도 단백질은 제거됩니다. 특정 분획을 회수하고 농축하면 프로테오믹스 분석이 용이해집니다.

질량 분석용 혈청 펩타이드 정제

분해 및 표지 처리

트립신과 같은 부위 특이적 프로테아제는 단백질을 작은 단편으로 절단하는 데 사용되며, 이를 통해 실험 스펙트럼을 단백질 데이터베이스의 이론적 스펙트럼과 대조하거나 분석 표준 물질과 비교함으로써 단백질을 식별할 수 있습니다. 상대적 정량 분석을 위해서는 아미노산 공급을 통해 안정 동위원소를 도입하여 세포 배양물을 대사적으로 표지하거나, 화학적 방법을 사용하여 시료에 안정 동위원소를 표지할 수 있습니다. 동위원소 표지된 합성 펩타이드를 시료에 첨가하면 선택적 반응 모니터링(SRM) 분석을 통해 절대 정량 분석이 가능합니다.