AAW™ 워크스테이션에서 Duolink^® 분석법 자동화 방법

본 프로토콜은 AAW™ 자동화 분석 워크스테이션을 사용하여 Duolink^® 분석을 자동화하는 방법을 상세히 설명합니다. 이 96웰 마이크로플레이트는 향상된 무인 운영 시간과 고처리량 기능을 제공합니다. 아래에서 세부 사항과 데이터를 확인하십시오.

자동화 및 Duolink^® 재료 필요

실험실 용기

• Opentrons^® 200 μL 팁 랙, 여과 처리됨 (제품 번호 99100105)
  • (1일차: 1박스, 2일차: 3~4박스)
• Opentrons^® 1,000 μL 팁 랙, 여과 처리됨 (제품 번호 99100106)
  • (1일차: 1박스, 2일차: 2박스)
• NEST 딥웰 96-웰 플레이트 (Opentrons^® 제품 번호 99900103)
• NEST 12-웰 리저버 (Opentrons^® 제품 번호 99900076)
• NEST 290mL 1-웰 저장 용기 (Opentrons^® 제품 번호 99900207)
• 분석 플레이트: 사각 웰 (Ibidi^® 제품 번호 89626 또는 89627 권장) 또는 원형 웰 (Corning^® 제품 번호 CLS3603 또는 유사 제품)

하드웨어

• AAW™ 자동 분석 워크스테이션 (제품 번호 99900241)
• AAW™ 8채널 피펫, 1,000 μL (제품 번호 99900245)
• AAW™ 1채널 피펫, 1,000 μL (제품 번호 99900246)
• AAW™ 플렉스 그리퍼 (제품 번호 99900244)
• Opentrons Flex™ 히터-셰이커 (견적 요청)
• Opentrons Flex™ 데크 확장 (4개입) (제품 번호 99900203)
• 옵션: Opentrons Flex™ 온도 모듈 (견적 요청)

시약

• Duolink^® 차단 용액 (제품 번호 DUO82007)
• 표적 단백질 특이적 1차 항체
  • 대조 키트는 마우스 항-EGFR 항체(제품 번호 E3138) 및 토끼 항-ErbB2/HER2 항체(제품 번호 HPA001383)를 사용합니다.
• Duolink^® PLA 프로브 (5배 농축) (1차 항체의 숙주 종과 일치하는 서로 다른 종의 PLUS 및 MINUS 각 1개)
  • 제품 번호 DUO92002 및 제품 번호 DUO92004 또는 유사 제품
• 항체 희석액 (제품 번호 DUO82008) – PLA 프로브 및 필요한 경우 1차 항체 희석용
• 연결용 저장액 (5배) – Milli-Q^® 실험실용 정수 시스템과 같은 고순도 정수로 희석하여 1배 연결 완충액 (제품 번호 DUO92008 또는 유사 제품)을 제조
• 리가아제 (1 U/μL, 40x) – 리가이션 버퍼로 1x로 희석하여 리가이션 용액 제조 (제품 번호 DUO92008 또는 유사 제품)
• 증폭 스톡 (녹색, 주황색, 적색, 원적외선) (5배 농축액) (제품 번호 DUO92008 또는 동급) – 고순도 물에 희석하여 1배 증폭 버퍼 제조
  • 참고: 아래 데이터는 적색 검출 시약을 사용함
• 폴리머라제 (10 U/μL, 80배) – 증폭 용액 제조를 위해 증폭 버퍼로 1배로 희석 (제품 번호 DUO92008 또는 유사 제품)
• 세척용 완충액 A 및 B (제품 번호 DUO82049)
  • 검사를 시작하기 전에 한 포의 내용물을 고순도 물에 최종 부피 1,000 mL가 되도록 용해하여 준비해야 합니다. 용액은 단기 보관(2주 미만) 시 실온에서, 장기 보관 시 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  • 참고: 사용 전 용액을 실온으로 되돌려야 합니다.
• 0.01x 세척 버퍼 B
  • 검사를 시작하기 전에 1x 세척 완충액 B를 고순도 물로 1:100 희석하여 준비해야 합니다.
• DAPI(10x)(제품 번호 DUO82064) - 고순도 물로 1x로 희석
• 안티페이드 (10배) (제품 번호 DUO82064) - 고순도 물로 1배로 희석

Duolink^® 프로토콜 업로드

Millipore^® 프로토콜 라이브러리에서 선택한 Duolink^® PLA 96-웰 프로토콜을 다운로드하여 Opentrons^® 앱에 업로드하십시오. 현재 이용 가능한 프로토콜은 1) 항체 농도 또는 양성/음성 대조군 검사를 위한 Duolink^® 구성 요소 테스트 프로토콜 또는 2) 고객이 선택한 단일 항체 쌍 조합 및 농도로 최대 96개 샘플을 실행할 수 있는 Duolink^® 멀티웰 플레이트 분석 프로토콜 중 하나를 선택할 수 있습니다. 각 프로토콜은 정사각형 또는 원형 96-웰 버전으로 제공됩니다.

1. Duolink^® 구성 요소 테스트 분석 1일차
2. Duolink^® 구성 요소 테스트 분석 2일차
3. Duolink^® 멀티웰 플레이트 1일차
4. Duolink^® 멀티웰 플레이트 2일차

AAW™ 워크스테이션 설정

AAW™ 워크스테이션을 사용하여 Duolink^® PLA 분석을 자동화했습니다. 분석 프로토콜을 Python 코드로 변환하여 워크스테이션의 Opentrons^® 앱으로 가져왔습니다. 기기는 모든 액체 처리 단계, 배양 및 교반 단계를 수행했습니다. 온도 모듈 옵션을 선택한 경우 모든 분석 단계가 무인 자동화됩니다. 선택하지 않은 경우, 필요에 따라 데크에 온도 민감성 시약을 추가하기 위해 3번의 간단한 수동 개입 단계가 필요합니다.

Duolink^® 분석을 위한 장비 준비

1. Millipore^® 프로토콜 라이브러리에서 선택한 Duolink^® 프로토콜 파일을 다운로드하고 위에서 설명한 대로 컴퓨터의 Opentrons^® 앱에 로드하십시오. 그런 다음 "Send to Opentrons FLEX" 또는 "Start Set-up" 기능을 통해 프로토콜을 AAW™ 워크스테이션으로 전송할 수 있습니다.
2. AAW™ 사용자 매뉴얼에 따라 적절한 위치에 적합한 모듈, 고정 장치 및 피펫이 장착되고 보정되었는지 확인하십시오.
3. 프로토콜이 로봇으로 전송되면 프로토콜을 선택하고 "설정 시작" 버튼을 눌러 분석을 시작할 수 있습니다. 특정 분석 매개변수를 선택할 수 있는 매개변수 목록이 표시됩니다. 운영자는 변경할 수 있지만 기본 선택 사항이 설정되어 있습니다:

1일차

1. 샘플 수: 1-96
   1. 참고: 풀 플레이트 프로토콜 선택 시에만 적용
2. 드라이 런: 연습용으로 사용 시 활성화(기본값) 또는 비활성화(인큐베이션 및 세척 단계 단축)
3. 데크 위 배양: 켜기(기본값), 끄기 
4. 플레이트 뚜껑 사용: 켜기(기본값), 끄기는 AAW™ Flex 그리퍼가 플레이트를 덮도록(ON) 하거나 사용자가 수동으로 플레이트를 덮도록(OFF) 선택할 수 있음

2일차

1. 샘플 수: 1-96
2. 드라이 런: 켜기 또는 끄기(기본값) - 배양 및 세척 단계를 단축한 연습용 실행으로 사용
3. 데크에서 배양: 켜기(기본값), 끄기
4. 플레이트 뚜껑 사용: 켜기(기본값), 끄기 선택 시 AAW™ Flex 그리퍼가 플레이트를 덮도록 설정(켜기)하거나 사용자가 수동으로 플레이트를 덮도록 설정(끄기)할 수 있음
5. 온도 모듈 사용: 켜기(기본값), 끄기 선택 시 2일차 전체를 완전 무인화 가능. 미사용 시 온도 민감성 시약 추가를 위해 3단계 수동 개입 필요

4. 실행 시작 전, 터치스크린 또는 Opentrons^® 앱의 단계별 지침에 따라 실험 용기 위치 확인을 최소 한 번 수행해야 합니다. 실험 용기 오프셋이 확인되면 AAW™ 워크스테이션은 향후 실행을 위해 이 값을 저장하며, 원하는 경우를 제외하고는 반복할 필요가 없습니다. 실험 용기 위치 확인은 드라이 런 중 비어 있는 실험 용기로 실행하거나 시약이 준비된 실험 용기로 실행할 수 있습니다. 온도 모듈 선택 여부에 따라 올바른 실험 용기 위치 오프셋이 사용되도록 확인하십시오.

Duolink^® 분석 설정 절차

Duolink^® PLA는 멀티웰 플레이트용 제품 설명서에 따라 수동으로 수행하거나 AAW™ 워크스테이션의 조정된 프로토콜을 사용하여 수행했습니다(아래 참조). 어세이 모든 단계는 기기 데크에서 수행되었습니다. 온도 모듈이 선택된 경우, 2일차에 수동 개입 단계가 필요하지 않습니다. 선택되지 않은 경우, 온도에 민감한 리가제 및 중합효소/증폭 용액을 추가하기 위한 일시 정지가 프로토콜에 포함됩니다. 위에서 언급한 바와 같이, 각 프로토콜은 정사각형 또는 원형 96-웰 버전으로 제공됩니다. 정사각형 웰에서 실행되는 분석은 웰당 80µL의 시약 용량이 필요하며, 원형 웰에서는 웰당 40µL가 필요합니다. 100RXN Duolink^® 키트는 원형 웰에 충분한 용량이지만, 정사각형 웰의 80µL 웰 용량을 고려할 경우 추가 시약 구매가 필요할 수 있습니다.

실행 전 준비

1. 다중웰 플레이트에서 세포를 배양한 후 표준 면역염색 프로토콜에 따라 처리(기아, 자극 등), 세척 및 고정합니다. 1차 항체 조건은 시료 고정, 항원 회수, 차단 용액, 항체 희석액, 농도, 배양 온도 및 시간에 대해 최적화해야 합니다.
   1. 이 EGFR/HER2 적용을 위해 SK-OV3 세포를 멀티웰 플레이트(사각형 및 원형 웰)에서 배양하고, EGF로 자극한 후 Duolink^® Control Kit 제품 정보 시트 및 멀티웰 플레이트 프로토콜의 지침에 따라 고정했습니다.
2. AAW™ 워크스테이션에서 Duolink^® 프로토콜을 실행하기 전에, 1차 항체가 세포 내 표적에 도달할 수 있도록 세포를 10분간 투과 처리해야 합니다(1´ PBS(제품 번호 P3813)에 0.2% Triton X-100(제품 번호 T8787) 용액).
3. 세포를 PBS로 2분간 두 번 세척하고, 부드럽게 흔들어 준 후, 분석을 실행하기 직전에 플레이트에서 과잉 PBS를 즉시 제거하십시오.

1일차

시약 준비

1일차 시약 준비는 Duolink^® PLA 형광 프로토콜을 따르십시오.

1. Duolink^® Component Testing Assay 또는 Duolink^® Multiwell Plate Assay용 1차 항체 희석액을 준비하십시오. Duolink^® Component Testing Assay를 사용하면 양성/음성 대조군 항체 조합을 확인하거나 다양한 항체 농도를 테스트할 수 있습니다.
   
2. 
   
   1. EGFR/HER2 Duolink^® 구성 요소 테스트 분석의 경우, 1차 항체(마우스 항-EGFR(제품 번호 E3138) 및 토끼 항-ErbB2/HER2(제품 번호 HPA001383))를 Duolink^® PLA 항체 희석제(제품 번호 DUO82008)로 각각 최종 농도 1:100 및 1:5,000이 되도록 희석하였습니다. 테스트된 항체 조건은 음성 대조군 -EGFR/-HER2, +HER2/-EGFR, -HER2/+EGFR 및 양성 대조군 +HER2/+EGFR이었습니다.
   2. 96개 샘플 EGFR/HER2 Duolink^® 멀티웰 플레이트 분석을 위해, 1차 항체(마우스 항-EGFR 항체 및 토끼 항-ErbB2/HER2)를 Duolink^® PLA 항체 희석제(제품 번호 DUO82008)로 각각 최종 농도 1:100 및 1:5,000이 되도록 희석했습니다. 양성 대조군 +HER2/+EGFR 1차 항체로 전체 플레이트를 실행했습니다.
3. 항체는 분석 실행 유형(구성 요소 테스트 대 멀티웰 플레이트)에 따라 NEST Deep Wall Reagent Plate에 로드됩니다.
   1. 구성 요소 테스트 분석의 경우: 4 세트의 양성 또는 음성 대조군 항체(또는 농도)를 A1-D1 웰에 로드합니다.
   2. 멀티웰 플레이트 분석의 경우: 단일 항체 용액을 A1-H1 웰에 로드합니다.
      참고: 분석 실행 유형별 분석 용량은 분석 시작 시 앱 또는 터치 스크린에 표시됩니다. 샘플 수가 96개가 아닌 경우, 정확한 필요한 용량은 Opentrons^® 앱 또는 터치 스크린을 참조하십시오.
4. Duolink^® 차단 용액은 시약 플레이트의 A2-H2 웰에 첨가해야 합니다. 프로토콜 시작 시 앱 또는 터치스크린에서 용량을 확인할 수 있습니다.

로봇 데크 구성 및 자동화 분석 프로토콜

1. 모든 시약을 NEST Deep 96-well 시약 플레이트의 해당 웰에 배치한 후, 아래 목록과 그림 1, 그림 2에 표시된 대로 실험 용기를 데크의 적절한 위치에 배치할 수 있습니다:
   1. B2 위치에 P200 팁 1박스
   2. B3 위치에 P1000 팁 1박스
   3. C1 위치: NEST Deep 96-웰 시약 플레이트
   4. C2 위치에 샘플 플레이트
   5. C4 위치: 샘플 플레이트 뚜껑
   6. D2에 NEST 290mL 저장조

2. 모든 실험용 기구가 제자리에 배치되면 로봇 도어를 닫을 수 있습니다. 이후 상기 AAW™ 워크스테이션 설정 섹션에 설명된 대로 설정 시작 버튼을 선택하고, 매개변수를 선택한 후 (아직 수행하지 않았다면) 실험용 기구 위치 검사를 수행할 수 있습니다. 설정 시작 기능이 이미 활성화되고 매개변수가 선택된 경우, 파란색 "실행 화살표"를 선택하여 분석을 시작할 수 있습니다.
3. 이제 AAW™ 워크스테이션이 프로토콜을 실행합니다.
4. 프로그램이 완료되면, 1차 항체가 추가된 분석 플레이트가 C2에서 준비되어 4°C에서 오프덱(off-deck) 하룻밤 배양을 기다립니다.

2일차

시약 준비

온도 모듈을 사용하는 경우, 모든 용액은 분석 시작 시에 제조하여 자동 분석이 진행되는 동안 4 °C로 유지할 수 있습니다.

온도 모듈을 사용하지 않는 경우, 사용 직전에 구성 요소를 준비하고 내장 프로그램의 지시에 따라 일시 정지된 동안 시약 웰에 첨가하십시오.

시약 준비에는 Duolink^® PLA 형광 프로토콜을 따르십시오. 시약의 부피는 Opentrons^® 앱 또는 AAW™ 터치스크린에서 분석 시작 시 확인할 수 있습니다.

1. PLA 프로브를 시약 딥 웰 플레이트의 A1-H1 웰에 넣으십시오.
2. 준비된 리가아제 용액(1x 리가아제 + 1x 리가아제 버퍼)을 시약 딥웰 플레이트의 A2-H2 웰에 넣으십시오.
3. 준비된 증폭 용액(1x 폴리머라제 + 1x 증폭 버퍼)을 시약 딥웰 플레이트의 A3-H3 웰에 넣으십시오.
4. 시약 딥웰 플레이트의 A4-H4 웰에 1x DAPI 핵 염색액을 넣으십시오.
5. 시약 딥웰 플레이트의 A5-H5 웰에 1x 안티페이드를 넣으십시오.
6. 세척 버퍼
   1. 세척 버퍼 A
      1. Duolink^® 구성 요소 테스트 플레이트: NEST 12-웰 저장소의 웰 1-6
      2. Duolink^® 멀티웰 플레이트: NEST 290mL 저장소
   2. 세척 버퍼 B
      1. Duolink^® 성분 테스트 플레이트: NEST 12-웰 저장소의 웰 7-8
      2. Duolink^® 멀티웰 플레이트: NEST 12-웰 저장소의 웰 1-4
   3. 세척 버퍼 0.1x B
      1. Duolink^® 구성 요소 테스트 플레이트: NEST 12-웰 저장소의 웰 9
      2. Duolink^® 멀티웰 플레이트: NEST 12-웰 리저버의 웰 5-6
   4. PBS
      1. Duolink^® 성분 테스트 플레이트: NEST 12-웰 리저버의 웰 10
      2. Duolink^® 멀티웰 플레이트: NEST 12-웰 리저버의 웰 7-8

로봇 데크 구성 및 자동화 분석 프로토콜

1. 모든 시약이 NEST Deep 96-웰 시약 플레이트의 적절한 웰에 배치되면, 아래에 나열되고 그림 3 및 그림 4에 표시된 대로 실험 용기를 데크의 적절한 위치에 배치할 수 있습니다:
   1. Duolink^® 구성 요소 테스트 분석을 위한 A1, A2, B1, B2 위치에 P200 팁 4박스 또는 Duolink^® 멀티웰 플레이트 분석을 위한 A1, A2, B1 위치에 P200 팁 3박스
   2. A3 및 B3 위치에 P1000 팁 2박스
   3. C1 위치에 NEST Deep 96-웰 시약 플레이트 (온도 모듈 유무 선택 가능)
   4. C2의 샘플 플레이트(사각형 또는 원형 96-웰 플레이트) 및 C4의 샘플 플레이트 뚜껑
   5. Duolink^® Component Testing assay용 C3의 NEST 12-well Reservoir 세척 버퍼
   6. Duolink^® 멀티웰 플레이트 분석용, B2의 세척 버퍼 NEST 12-웰 리저버 및 C3의 NEST 290mL 리저버
   7. D2에 비어 있는 NEST 290mL 저장조

2. 시작 설정 기능이 이미 활성화되고 매개변수가 선택된 경우, 파란색 "실행 화살표"를 선택하여 분석을 시작할 수 있습니다.
3. AAW™ 워크스테이션이 이제 프로토콜을 실행합니다.
   1. 온도 모듈을 사용하는 경우 수동 개입이 필요하지 않습니다.
   2. 온도 모듈을 사용하지 않는 경우, 온도에 민감한 시약(리가제, 중합효소 등)을 추가하라는 프롬프트와 함께 프로토콜 일시 정지 기능이 내장되어 있습니다. 터치스크린에는 다음 일시 정지 단계까지의 시간이 표시되므로, 작업을 조정하고 자리를 비울 수 있습니다.
4. 프로그램이 완료되면 분석 플레이트는 형광 이미징을 위해 C2에서 준비됩니다.

자동화 Duolink^® 분석 대 수동 분석 결과

자동화 Duolink^® 프로토콜은 사각형 및 원형 멀티웰 플레이트에서 EGFR-HER2 제어 키트 시약을 사용하여 테스트되었습니다. Duolink^® 구성 요소 테스트 분석은 EGF 처리된 SK-OV3 세포의 음성 대조군(1차 EGFR/HER2 항체 없음) 및 양성 대조군(EGFR/HER2 항체 모두)을 대상으로 수행되었습니다.  Duolink^® 구성 요소 테스트 프로토콜을 사용한 EGFR-HER2 제어 키트 분석의 수동 및 AAW™ 워크스테이션 성능에 대한 형광 이미지는 음성 대조군에서 EGFR-HER2 공동 국소화가 없음을, 양성 대조군에서 공동 국소화(점상)가 있음을 보여줍니다(그림 5). 이 결과는 여러 실행과 두 가지 플레이트 형상 유형 모두에서 재현 가능했습니다(그림 6). ImageJ 분석을 통해 양성 염색 영역 비율에 대한 반정량적 평가를 수행하였습니다(그림 7).

AAW™ 워크스테이션 자동화 Duolink^® 분석법은 Duolink^® Component Testing 프로토콜을 이용한 항체 검사와 Duolink^® Multiwell Plate 프로토콜을 이용한 샘플 스크리닝(최대 96개 입력)을 모두 수행할 수 있습니다. 본 연구에서는 Duolink^® Multiwell Plate 프로토콜을 EGF 처리 대조군 대비 미처리 SK-OV3 세포(각 48웰)에 적용하여 평가하였습니다. EGF 처리군과 미처리군의 EGFR-HER2 공위화(colocalization)를 나타내는 대표 형광 이미지는 그림 8a에 제시되어 있습니다. 양성 염색 영역 비율(%)을 통한 공위화의 반정량적 평가 결과, EGF 처리군에서 통계적으로 유의미하게 높은 EGFR-HER2 상호작용(약 2.5배)이 관찰되었습니다(그림 8b).

마지막으로, 자동화 분석법과 수동 분석법의 분석 시간 및 무인 작업 시간을 종합하여 비교했습니다. 사이클 시간은 매우 유사하지만, 주요 이점은 작업 시간이 단축된다는 점입니다. Duolink^® 검사는 1일차에 약 1.5시간, 2일차에 5~7시간이 소요됩니다. 자동화 프로토콜을 적용하면 이 시간의 95%가 무인 작업이며, 온도 모듈을 도입할 경우 100% 무인 작업이 가능합니다.

요약

본 문서는 AAW™ 자동화 분석 워크스테이션에서 Duolink^® 근접 리게이션 분석 기술을 활용하는 방법을 제시하며, 워크어웨이 프로토콜이 숙련된 사용자의 수동 작업과 동등한 성능을 발휘함을 보여줍니다.

아래에서 AAW™ 워크스테이션에 대한 추가 정보를 요청하십시오.