단백질 구조 배열 다중화

자세히 알아보기

• 성공적인 바이오시밀러 단클론항체 개발을 위한 HOS 이해
• 단백질 구조 배열 기술
• 공정 개발을 위한 HOS 분석에 PCA ELISA 활용
• FDA 제출을 위한 HOS 분석에 PCA ELISA 활용
• 신규 mAb 개발을 위한 고처리량 PCA를 위한 InnoPlex
• 참고문헌

성공적인 바이오시밀러 단클론항체 개발을 위한 HOS 이해

단일클론 항체(mAbs)는 생물학적 제제 분야에서 가장 빠르게 성장하는 인간 치료제 계열로, 현재 승인률을 기준으로 2020년까지 전 세계 매출이 1,250억 달러에 달할 것으로 예측됩니다. 시장에 출시되는 치료용 mAbs의 수가 지속적으로 증가함에 따라, 이에 상응하는 바이오시밀러의 수 증가도 예상됩니다.¹

미국 식품의약국(FDA)의 바이오시밀러 정의는 기존 FDA 승인 참조 제품과 매우 유사하며 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 생물학적 제제를 의미합니다. 

바이오시밀러 mAb 생산은 이 분자들의 생물학적 기능에 핵심적인 요소인 3차원(3D) 구조가 매우 복잡하기 때문에 어렵습니다. 바이오시밀러 mAb와 그 기반이 되는 참조 치료용 mAb 사이의 작은 구조적 차이조차도 분자의 안전성, 효능 및 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

mAb의 3D 구조는 1차, 2차, 3차 및 4차 구조의 복합적 효과와 더불어 번역 후 변형의 영향으로 형성됩니다. 고차 구조(HOS)로 불리는 이 형태는 기초 유전자뿐만 아니라 바이오시밀러 생산을 위한 세포주 선택, 온도, pH, 광노출과 같은 생물공정 조건, 제형화 방법 등 다양한 요인의 영향을 받습니다.

고려해야 할 변수가 너무 많기 때문에, 바이오시밀러 mAb가 기준 제품과 동일하지 않은 경우가 흔합니다. 이러한 차이로 인해 발생할 수 있는 다양한 문제를 피하기 위해, 2015년 발표된 FDA 지침은 제안된 제품의 바이오시밀러성을 기준 제품과 비교 평가하기 위해 광범위하고 견고한 비교 물리화학적 및 기능적 연구를 수행할 것을 권고합니다.²

현재 HOS 분석 방법은 아래와 같으나, 이들 모두 mAb의 3차원 구조에 대한 유용한 정보를 제공함에도 불구하고 민감도와 경제성을 동시에 갖춘 방법은 없습니다:

• 원편광 분광법
• 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
• 분석용 초원심분리법(AUC)
• 비변성 전기영동
• 수소/중수소 교환 질량 분석법(HDX/MS)
• NMR 분광법

이러한 방법의 한계와 FDA 요구 사항을 충족하기 위한 노력으로 인해, 참조 제품과 비교하여 바이오시밀러 mAb의 HOS를 분석하기 위한 대체적이고 처리량이 더 높은 접근 방식에 대한 필요성이 점점 더 커지고 있습니다. 머크는 Array Bridge Inc.의 단백질 구조 배열(PCA) 기술에 대한 독점적 유통 및 연구 상업적 권리를 취득함으로써 연구자들에게 이 문제에 대한 편리한 해결책을 제공합니다. 세인트루이스 캠퍼스 인근에 위치한 Array Bridge Inc.는 분자 수준에서 바이오시밀러의 비교 가능성 측정에 풍부한 경험을 보유하고 있습니다.

단백질 구조 배열 기술

Array Bridge Inc.의 Wang 등은 2013년 Frontiers in Pharmacology에 게재한 논문에서 mAb HOS 탐색을 위한 정교한 항체 어레이 개발을 기술했습니다.³ 전체 mAb 구조를 포괄하는 중첩 영역을 가진 펩타이드 면역원(immunogen)에 대한 다클론 항체(pAbs)를 생성함으로써, 저자들은 거의 동일한 아미노산 서열을 공유함에도 불구하고 시판 중인 서로 다른 mAb들이 고유한 HOS 서명을 지닌다는 점을 입증했습니다.

HOS 시그니처는 항체 구조의 화학적 변형 및/또는 물리적 변화로 인해 pAb 패널에 의해 검출되는 서로 다른 mAb 종의 관찰 가능한 변화를 나타냅니다. 이를 더 잘 이해하기 위해서는 패널 내 각 pAb가 선형 또는 이차 구조 항원결정기(epitope)에 결합한다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 이 항원결정기는 mAb가 올바르게 접힌 천연 형태일 때 접근 불가능하거나 부분적 또는 완전히 노출될 수 있습니다. 이러한 에피토프들이 항체 구조의 해리 또는 잘못된 접힘으로 인해 표면에 노출되면 신호 변화가 발생합니다.

이러한 항체 어레이에서 생성된 정보는 원본 mAb의 벤치마킹, 이 제품과 비교한 바이오시밀러 분석, 그리고 새로운 mAb의 임상적으로 관련성 있는 효과로 이어질 수 있는 구조적 변화를 확인하는 데 사용될 수 있습니다.

PCA 기술은 사용이 매우 쉽습니다. 운영이 쉬운 ELISA 형식으로 실행되는 이 분석법은 mAb 개발의 모든 단계에서 유용하게 사용될 수 있는 mAb HOS의 신속하고 정확하며 민감한 측정을 제공합니다.

항체 어레이 내 34개 항체의 분포. PCA 기술이 적용된 pAb 어레이는 전체 mAb의 아미노산 서열을 포괄합니다.

공정 개발을 위한 HOS 분석에 PCA ELISA 활용

mAb 제조 공정 수립 시 다양한 조건을 신중하게 최적화해야 합니다. 세포주 공학, 배지 및 첨가제 선택, 공정 개발에서 비롯된 변화는 치료용 mAb의 HOS(항체 특이성) 변화를 초래할 수 있습니다. 머크의 RituBridge PCA ELISA를 사용하여 생성된 다음 데이터는 다양한 가혹한 조건(산화, 열 및 높은 pH)이 CD20 양성 비호지킨 림프종의 다양한 형태를 치료하는 데 사용되는 mAb Rituxan의 HOS에 미치는 영향을 보여줍니다. 세 가지 조건 모두 항체를 변성시켰으나, 각 조건별 변성 패턴은 현저히 달라 시험된 각 조건에서 서로 다른 HOS 지문을 생성했습니다.

산화, 열 및 pH 변화가 리툭산에 미치는 영향은 RituBridge PCA ELISA 1(3종 중 1종)을 사용하여 측정되었습니다. 광밀도에서 급격한 상승은 일반적으로 접근 불가능한 항원결정기(에피토프)가 노출될 때 발생하며, 이는 HOS(고분자화) 변화를 나타냅니다.

FDA 제출을 위한 HOS 분석에 PCA ELISA 활용

PCA ELISA는 단일클론항체(mAb)에 대한 물리화학적 조건의 영향 평가 외에도, 바이오시밀러와 원개발자 분자의 여러 배치 간 비교에도 활용될 수 있습니다. 아래 데이터는 후보 바이오시밀러가 원개발자 분자와 우수한 유사성을 보이며, 항체 영역 9에서만 잠재적 편차가 있음을 명확히 보여줍니다.

바이오시밀러가 원개발자 분자와 다른 HOS 특성을 보일 수 있지만, 이러한 변화가 항상 임상적으로 관련성이 있는 것은 아니라는 점을 유의해야 합니다. PCA ELISA 데이터는 FDA 제출을 뒷받침하는 데 필요한 증거에 상당한 가치를 더합니다.

바이오시밀러와 오리지네이터 분자의 다섯 가지 다른 배치 간 비교를 통해 성능 편차가 존재할 수 있는 네 가지 영역(5, 9, 17 및 30)이 확인되었습니다.

신규 mAb 개발을 위한 고처리량 PCA용 InnoPlex

InnoPlex는 CHO 세포주에서 유래한 IgG1의 보존된 구조를 기반으로 신약 치료용 mAb를 특이적으로 표적하는 PCA입니다. 각 PCA ELISA 형식은 3개 화합물을 병렬 측정할 수 있지만, 머크는 InnoPlex라는 다중 분석법을 개발하여 이 분석법의 처리량을 플레이트당 중복 측정 기준 약 45개 화합물로 향상시켰습니다.

InnoPlex는 Luminex® Corporation의 xMAP® 기술과 InnoBridge ELISA를 결합하여 다양한 염료 조합으로 색상 코딩된 특수 마이크로스피어를 사용해 다중 분석물 동시 검출을 가능하게 합니다. 이러한 비드 표면에 pAb를 고정화함으로써 96웰 플레이트의 단일 웰 내에서 34개 표적 에피토프 각각을 동시에 스크리닝할 수 있게 되었습니다.

리투브리지(Ritubridge)와 이노브리지(InnoBridge)를 다중화하여 리투플렉스(RituPlex)와 이노플렉스(InnoPlex)로 만든 고처리량 PCA의 예시 데이터.

산성 및 염기성 조건 하에서 스트레스를 받은 바이오시밀러 후보물질

RituBridge ELISA 항체 1-34의 성능, xMAP 기술(RituPlex)로 다중화, 저 pH에서 처리된 알려진 바이오시밀러 Mab 대조군.

대조군 vs. pH3

Luminex xMAP™ 기술을 활용한 INNOPLEX 다중 PCA 분석법을 통해 pH 유도 스트레스 하에서 새로운 치료용 단일클론항체(알려지지 않은 바이오시밀러)의 변화를 검출함.

치료용 mAb의 면역원성 가능성은 이전에 잘 기록된 문제이며, 이 문제의 중요성은 Song 등(2018)의 연구에서 잘 보여집니다. 해당 연구에서 저자들은 치료용 항체 개발 시 HOS 분석에 InnoPlex 방법이 적합함을 입증했으며, 크기 배제 크로마토그래피와 같은 전통적 방법의 단백질 안정성 결과와 잘 상관관계를 보이는 PCA 데이터를 생성했습니다.^⁵

연구 저자들은 또한 mAb 간 다양한 구조적 차이를 발견했으며, 특히 처리 조건에 따라 항체 응집이 발생하여 항체 에피토프 노출이 현저히 증가한다는 중요한 관찰 결과를 제시했습니다. 이들은 이러한 현상이 면역원성을 유발할 수 있는 "이물질" 분자로 이어질 가능성이 있다고 지적했습니다.