크로마틴 면역침전법(ChIP)에 관한 자주 묻는 질문

ChIP 실험 가이드, 문제 해결 팁 및 보충 프로토콜에 대한 자세한 내용은 머크 크로마틴 면역침전(ChIP) 페이지를 참조하십시오.

항체

1. 단일클론 항체와 다클론 항체 중 어떤 것을 사용해야 할까요? ChIP에는
   단일클론 항체와 다클론 항체 모두 사용할 수 있습니다. 단일클론 항체는 일반적으로 높은 특이성을 보이지만, 가교 조건에 민감할 수 있습니다. 과도한 가교는 표적 항원결정기를 가릴 수 있으므로 가교 조건을 신중하게 최적화해야 할 수 있습니다. 다클론 항체는 과도한 크로스링크 조건에 덜 민감하며, 동등한 단클론 항체보다 더 나은 농축 효과를 보일 수 있지만, 비특이적 표적에 결합할 가능성이 더 높습니다.
   
   
2. 항체는 얼마나 사용해야 하나요? 표적 단백질의 풍부도와 항체의 표적 친화도에 따라
   ChIP 항체를 2-10 µg 사용하도록 권장합니다. 항체 양이 많다고 항상 신호가 강해지는 것은 아닙니다. 최적의 ChIP 신호를 얻으려면 항체 양을 적정하는 것이 좋습니다.
   
   
3. 선택한 항체가 ChIP에서 효과적으로 작용할 가능성을 높이려면 어떻게 해야 하나요?
   특이성/교차반응성 테스트를 통해 해당 항체가 인식하는 항원결정기를 확인하십시오. 또한 웨스턴 블롯, 면역세포화학, 면역침전법 등 다양한 면역분석법에서 항체를 테스트한 후, ChIP에서 표적 DNA에 대해 우수한 농축 배수를 생성하는지 확인해야 합니다.
   
   
4. 상업용 ChIP 항체를 어떻게 선택해야 하나요? 여러 특이성/교차반응성 테스트를 통과하고
   ChIP 및 다양한 면역분석법에서 검증된 항체를 선택하십시오.
   
   
5. 좋은 대조군 항체는 무엇인가요? ChIP 항체와 동일한 종의
   정상 IgG를 사용하는 것을 권장합니다. 따라서 마우스 단일클론 항체를 사용하는 경우, 정상 마우스 IgG를 권장합니다.
    

퓨전 태그

1. 융합 태그를 가진 단백질을 과발현시키려면 어떤 요소를 고려해야 하나요? 과발현이
   발생하는 모든 시스템은 거짓 양성 상호작용을 유발할 수 있습니다. 안정적으로 융합 태그가 발현되는 세포주를 분석하는 경우, 고발현 및 저발현 세포주를 사용하고, 대조군 비교를 위해 비전달 세포의 염색질로부터 모의 IP를 수행하는 것이 이상적입니다.
   
   
2. 연구에 적합한 ChIP 항체를 찾을 수 없는 경우 태그 사용을 권장하시나요? ChIP에서 태그
   항체를 사용하는 것은 항체 부족, 변동성 및 교차결합된 염색질에서의 에피토프 가림 현상을 해결하는 방법입니다. 태그가 전사 인자 기능에 간섭할 가능성도 있습니다. 태그는 사례별로 평가해야 합니다. N말단과 C말단 사이에서 태그를 전환하는 것이 좋은 대조군이 될 수 있습니다.
    

크로스링크 및 비드

1. 단백질 A/G 혼합 비드를 사용하는 장점은 무엇인가요?
   많은 항체는 단백질 A와 G 모두에 다양한 친화도와 특이성으로 결합합니다. 단백질 A와 G 비드를 혼합하면 둘 중 하나를 선택하거나 최적화를 위해 두 유형 모두에 대한 결합을 평가할 필요가 없습니다. 대부분의 경우, 순수 단백질 A 또는 단백질 G 비드를 비슷한 양으로 사용하는 것에 비해 단백질 A/G 혼합 비드를 사용할 때 더 높은 농축 배수와 감소된 배경 활성을 확인했습니다.
   
   
2. 가교 반응 단계를 퀴칭해야 하나요?
   퀴칭은 일반적으로 글리신 첨가로 수행됩니다. 그러나 일부 프로토콜에서는 배양 세포 고정 시 포름알데히드를 PBS로 세척하는 것만으로도 가교 반응을 중단시키기에 충분하다고 제안합니다. 이는 세포 고정 시 배양 배지에 혈청이 존재하는지 여부에 따라 달라집니다. 배양 배지에 혈청 단백질이 존재할 경우 글리신 퀴칭이 더 중요합니다.
   
   
3. 아가로즈 겔 전기영동 전에 크로스링크를 역전시키고 ChIP DNA를 용매 추출해야 하나요? 이 단계를
   수행하기 전에 크로스링크 역전은 매우 권장됩니다. 큰 복합체는 겔의 기공을 막아 전기영동을 지연시키고 높은 배경을 생성할 수 있습니다. DNA 정제는 샘플에 따라 선택적일 수 있습니다. 프로테아제 K 분해 및 크로스링크 역전 후 원시 DNA도 성공적으로 증폭 및 염색이 가능합니다.
   
   
4. 포름알데히드를 사용하지 않는 교차결합제를 고려해야 할까요? 특정
   시료에 따라 다를 수 있습니다. 경우에 따라 이중 교차결합제 사용이 권장됩니다. 자외선(UV) 교차결합도 시행되지만, UV 교차결합은 가역적이지 않아 ChIP DNA의 추가 분석을 불가능하게 합니다.
   
   
5. 시료의 과도한 교차결합 여부를 어떻게 판단할 수 있나요? 해당 표적에 대한
   ChIP 연구 경험이 없다면, 배양 세포를 실온에서 1% 포름알데히드로 10분간 처리할 것을 권장합니다. 농축 신호가 관찰되지 않으면서(해당 위치에 단백질이 존재할 것으로 예상되는 경우) 교차결합 시간을 15분 또는 20분으로 연장하십시오. 과도하게 교차결합된 경우 일반적으로 위치와 무관하게 동일한 신호가 관찰됩니다. 위치 독립성이란 알려진 결합 부위와 알려진 음성 대조군 부위(예: 4kb 떨어진 부위)에서 동일한 신호가 관찰됨을 의미합니다.
   
   
6. 히스톤을 크로스링크하지 않아도 되는 경우는 있나요? 네이티브
   ChIP에서는 히스톤 H3와 히스톤 H4가 매우 밀접하게 결합되어 있으므로 크로스링크가 필요하지 않습니다. 히스톤 H2A와 히스톤 H2B는 그 정도로 밀접하게 결합되어 있지는 않지만, 네이티브 ChIP에서도 여전히 작동합니다.
   
   
7. 조직 준비 절차에서는 세포 배양액에 포름알데히드를 사용하여 크로스링크 용액을 만들도록 명시되어 있지만, 다른 곳에서는 세포 배양액에 대한 언급이 전혀 없습니다. 추출 완충액 대신 세포 배양액을 사용하는 이유는 무엇이며, 다른 대체 물질은 무엇이 있을까요?
   세포는 생리적 조건(따라서 배지 사용)에서 교차결합(X-링크)되어야 합니다. 이는 생체 내에서 발생하는 DNA-단백질 상호작용을 동결 보존하기 위함입니다. 교차결합된 세포는 이후 저장액에서 부풀려지고, 균질화되어 핵이 방출되며, 핵 용해 완충액에서 염색질(chromatin)이 추출됩니다.
    

크로마틴 분쇄

1. 크로마틴 절단을 위해 효소 분해와 초음파 분쇄 중 어떤 방법을 선택해야 할까요?
   효소 분해는 초음파 분쇄만큼 효율적이지 않을 수 있으며, 37°C에서 분해 반응을 진행할 경우 항원 결정기(에피토프)가 손상될 수 있습니다. 그러나 단핵소좀, 이핵소좀 또는 삼핵소좀을 생성하기 위해 필요한 최적화 과정은 초음파 분쇄보다 효소 분해가 더 간단할 수 있습니다.
   
   
2. 초음파 처리에 가장 적합한 장비는 무엇인가요? 특정
   시료에 따라 다릅니다. 모든 유형의 초음파 장비를 사용할 수 있지만, 각 시료 유형에 맞게 초음파 처리 과정을 최적화해야 합니다.
   
   
3. 프로브 초음파 분쇄기를 사용할 경우, 프로브 팁은 어디에 위치시켜야 하나요?
   프로브 팁은 튜브 벽에 닿지 않도록 침수되어야 합니다. 배치 방식으로 염색질(chromatin)을 준비할 때는 최소 0.6mL(1.2mL가 더 일관성 있음) 용량의 15mL 원뿔형 튜브를 사용하고, 클램프 설정을 통해 프로브가 튜브 바닥 근처에 위치하되 벽에 닿지 않도록 하는 것을 권장합니다. 초음파 처리 과정 중 튜브 자체는 조절 가능한 플랫폼 위의 얼음 욕조에 담가야 합니다.
   
   
4. 초음파 처리에 문제가 있습니다. 초음파 처리 팁이 있을까요? 절차 전반(초음파
   처리 중 포함)에 걸쳐 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 초음파 처리 시간을 지나치게 길게 하지 않도록 주의하십시오(30초 이상 처리 시 시료 과열 및 변성 발생 가능).
   
   초음파 처리는 각 세포주와 장비에 맞게 최적화해야 합니다. 재현성 있는 처리를 위해 Diagenode Biodisruptor(수중 초음파 처리)를 권장합니다. 초기 설정으로 High "H" 모드에서 30초 작동/30초 정지 주기로 5분, 10분, 15분 처리하는 것이 좋습니다. 초음파 처리
   
   결과를 확인하려면 겔을 실행하세요:
   - 10 µL 시료에 40 µL H₂O를 첨가합니다
   . - 5 M NaCl 2 µL(최종 농도 0.2 M NaCl)을 첨가하여 가교를
   역전시킵니다. - 15분간 가열합니다
   . - 실온으로 돌아온 후, 37°C에서 10분간 10 mg/ml RNase
   A 1 µL를 첨가합니다. - Sigma-Aldrich GenElute PCR 정제 키트로 DNA 정제
   및 순도 향상 - 초음파 처리된 DNA 1~4 µL를 겔에 로딩하여 스미어 크기
   측정 - 200 bp부터 1 kb 사이의 DNA 크기 스미어(500 bp 전후 피크 포함, 2-3 뉴클레오솜)를 생성하는 초음파 처리 조건을 ChIP 반응에 사용해야 함.
   
    
5. 왜 DNA를 1000 염기쌍 미만(약 3개 뉴클레오솜 ~400-500bp)으로 분해해야 하나요? ChIP의 우수한
   분해능을 보장하기 위함입니다. 평균 단편 크기가 1000 bp를 초과할 경우, PCR 대상 서열을 포함하는 DNA를 추출할 수는 있으나 관심 단백질이 대상 서열에서 700 뉴클레오타이드 이상 떨어져 있을 수 있습니다.
    

세포 수, 완충액, 핵 분리 및 기타 사항

1. 크로마틴을 동결-해동 주기에 노출시키면 ChIP 결과에 영향을 미칠까요? 크로마틴 샘플 처리 시
   동결-해동 주기를 권장하지 않지만, 경우에 따라 ChIP 결과에 영향을 미치지 않은 사례도 있습니다. 이는 크로마틴이 저장된 버퍼에 따라 달라질 수 있습니다. 일부 프로토콜에서는 동결-해동 주기 동안 에피토프를 안정화시키기 위해 버퍼에 글리세롤을 포함시킵니다.
   
   
2. IP 전 ChIP 희석 완충액을 대량으로 사용하는 이유는 무엇인가요? 다른 비드에 다른 버퍼를 사용하는 것이 바람직합니까? 크로마틴 분해에 사용되는 용해 버퍼에 고농도 SDS
   (경우에 따라 1%)가 포함된 경우 크로마틴을 10배로 희석해야 합니다. 크로마틴을 희석하면 IP 비드와 항체가 세제 존재로 인해 변성되거나 영향을 받지 않도록 할 수 있습니다. 머크 ChIP 키트에서는 아가로즈 비드와 자기 비드 모두에 유사한 버퍼를 사용합니다.
   
   
3. 핵 분리 단계가 필요한가요? 크로마틴 추출
   전에 핵을 분리하면 세포질 단백질을 제거하여 배경을 줄일 수 있습니다.
   
   
4. 세포에서 핵을 분리했는지 어떻게 확인할 수 있나요? 상대조 현미경으로 시료를 관찰하여
   핵이 세포에서 분리되었는지 확인할 수 있습니다.
   
   
5. DNA와 간접적으로 연관된 보조 인자 같은 표적의 경우 몇 개의 세포를 사용해야 하나요? 1천만
   개의 세포를 권장합니다.

6. 세포 수를 늘릴 수 있나요? Imprint^® 크로마틴 면역침전 키트와 함께 사용할 수 있는 최대 및 최소 세포 수는 얼마인가요? 이 키트와 함께 사용할
   수 있는 세포 범위는 웰당 0.1~1백만 개/ChIP 샘플입니다. 웰당 1백만 개 이상의 세포를 사용하면 비특이적 결합이 증가하고 ChIP 반응의 특이성이 감소합니다. ChIP DNA의 높은 수율을 원할 경우, 다수의 개별 ChIP 반응에서 DNA를 풀링하여 다운스트림 처리(표지/하이브리다이제이션)를 진행하거나, ChIP-chip 분석을 위해 WGA 2 키트를 사용하여 DNA를 증폭할 수 있습니다.
   
   
7.  qPCR 수행 시 GAPDH 프라이머의 효율은 얼마입니까? qPCR 수행 시
   GAPDH 프라이머의 효율은 95%입니다.
   
   
8. 초음파 처리가 불가능한 경우 Imprint^® 염색질 면역침전 키트는 용해 효소와 호환됩니까?
   예, 효소적 분해(미코코칼 뉴클레아제, MNase)를 통해서도 절단된 염색질을 제조할 수 있습니다(키트에 시약/프로토콜 미제공). MNase 처리량과 시간은 세포주에 따라 사용자가 최적화해야 합니다.
   
   
9. 핵 준비 버퍼의 기능은 무엇인가요? 프로테아제 억제제는 언제 첨가하나요? 핵 준비
   버퍼는 세포를 부풀게 하여 후속 균질화 단계에서 핵 방출을 용이하게 하는 저장액 염 용액입니다. 프로테아제 억제제 칵테일은 사용 직전에 첨가해야 합니다.
   
   
10. Imprint® 염색질 면역침전 키트를 식물이나 파충류 세포에 사용할 수 있나요? 예
    , 사용자가 교차결합 조건과 적절한 크기의 초음파 처리된 염색질 준비 조건을 최적화했다면, 식물이나 파충류 세포에서 준비된 초음파 처리된 염색질과 호환됩니다.
    
    
11. 조직으로 ChIP을 수행하려면 어떻게 해야 하나요?
    일반적으로 신선하거나 냉동된 조직에서 크로마틴을 준비할 수 있으며, 1% 포름알데히드 용액에 15분간 고정할 수 있습니다. 그러나 크로마틴 분리 전 조직을 분해하거나 균질화하는 방법에는 다양한 변형이 존재합니다. 조직 샘플을 ChIP에 활용하기 위한 보다 간편한 접근법으로 Magna ChIP G Tissue Kit (17-20000)를 시도해 볼 수도 있습니다. UC Davis의 Farnham 연구실과 같은 기관에서 제공하는 조직 ChIP 프로토콜과 뇌 조직을 위한 여러 공개된 방법들도 존재합니다.
    
    
12. 한 번에 몇 개의 ChIP 반응을 수행할 수 있나요? 현재 시판되는
    방법을 사용하면 96-웰 플레이트에서 최대 96개의 ChIP 반응을 동시에 수행할 수 있습니다. 대량 처리 연구를 위해서는 포함된 대조군과 함께 Magna ChIP™ HT96 ChIP Kit (17-10077) 또는 EZ-Magna ChIP™ HT96 Kit (17-10078)를 권장합니다.

데이터 분석

1. 겔 분석과 정량적 실시간 PCR(qPCR) 중 어떤 방법을 수행해야 할까요? qPCR을 권장합니다. 이는 분석의 대수적 증폭
   단계에 도달하기 위해 사이클 수를 최적화할 필요가 없기 때문입니다. 전사 인자의 경우 농축도가 낮을 수 있으나, qPCR은 정성적 분석보다 정량적 분석이 가능합니다.
   
   
2. 면역침전된 DNA를 정량화하려면 어떻게 해야 하나요? ChIP
   실험에서 정제한 DNA는 증폭 올리고가 특정 기준을 충족할 경우 PCR로 정량화할 수 있습니다. 올리고는 24머어(24-mer)여야 하며, GC 함량은 50%(±4), Tm은 60.⁰°C(±2.0)이어야 합니다. PCR 반응이 증폭의 선형 범위 내에 있는지 반드시 확인해야 합니다. 일반적으로 이를 달성하는 데 시간이 소요됩니다. 너무 많은 입력 DNA는 결과에 영향을 미치므로, 각 실험마다 여러 개의 튜브를 설정하여 입력 DNA를 최적화하십시오. 일반적으로 효모의 경우 약 1/25에서 1/100, 포유류 세포의 경우 약 1/10 정도이지만, 항체와 입력 염색질의 양에 따라 달라집니다.
   
   또한 20사이클 이상 사용하지 말고, dNTP가 항상 과잉 상태를 유지하도록 하십시오. 또한 각 반응에 실험 대조군 프라이머(실험 밴드를 비교하기 위한 것으로, 적절한 분리를 위해 크기가 충분히 달라야 함—보통 75 염기쌍이면 충분함)를 포함시키되, 실험 조건 전반에 걸쳐 변화하지 않아야 할 게놈 영역에 설정하십시오. 또한 정제된 입력 DNA(ChIP 없음)로부터 PCR을 수행하고 항체 미사용 대조군 PCR도 포함하십시오. PCR 산물은 500 염기쌍을 초과하지 않아야 하며 관심 영역(히스톤의 아세틸화 또는 메틸화 변화가 예상되는 부위)을 포괄해야 합니다. 모든 PCR 산물은 7-8% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하고 SYBR Green 1(Molecular Probes)을 1:10,000 희석(1X Tris-borate-EDTA 완충액, pH 7.5)하여 30분간 염색합니다. 탈색은 필요하지 않습니다.
   
   정량 분석은 Molecular Dynamics Storm 840 또는 860 겔 스캐너에서 청색 형광 모드(PMT 전압 900)로 겔을 스캔한 후 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 이는 에티디움 브로마이드 염색에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다. SYBR Green은 훨씬 더 민감하며, 에티디움 염색 겔의 조명은 사용 중인 라이트 박스의 UV 램프 품질에 따라 겔 전체에 걸쳐 차이가 발생할 수 있습니다. 자세한 내용은 Strahl-Bolsinger 등(1997) Genes Dev. 11: 83-93을 참조하십시오.
   
   
3. 백분율 농축도를 어떻게 측정하나요? 한
   가지 방법은 입력 DNA의 연속 희석 복제물을 ChIP DNA 및 항체 대조군 샘플과 함께 동시 PCR 반응으로 실행하는 것입니다. 얻어진 Ct 값을 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 시험 샘플을 이 곡선에 맞추어 백분율 농축도를 결정할 수 있습니다. (qPCR 및 데이터 분석 섹션 참조).
   
   
4. qPCR 결과의 오차(동일 실험 내 또는 실험 간 변동)는 어떻게 보고하나요? 모든
   qPCR을 중복으로 수행하고 평균 Ct값과 표준 오차를 계산하십시오. 그런 다음 https://www.eoas.ubc.ca/courses/eosc252/error-propagation-calculator-fj.htm과 같은 오차 전파 계산기를 사용하여 농축도 계산
   
   전반에 걸쳐 해당 표준 오차를 전파하십시오.
5. 상대 Ct 방법에서 시험 시료를 IgG만으로 정규화하는 것이 바람직합니까? 비교
   분석의 표준 관행은 표적 증폭산물과 참조 증폭산물 모두에 대해 모의 IP, ChIP IP 및 입력 시료를 사용하는 것입니다. 추가 시료 없이 모의 IP(IgG) Ct 값만을 정규화 기준으로 사용하는 것은 권장되지 않습니다.
   
   
6. 정상 IgG 대조 항체에 대해 허용 가능한 입력량(%) 범위는 어떻게 되나요? IgG
   풀다운은 상당히 변동성이 크며 qPCR 분석법에 따라 달라질 수 있습니다. 동일한 모의 IgG 샘플도 분석법 설계의 염기서열 구성에 따라 게놈의 한 위치와 다른 위치에서 서로 다른 입력량(%) 결과를 보일 수 있습니다. 신호는 핵산이 튜브, 비드, 항체에 비특이적으로 결합한 결과일 수 있습니다. ChIP은 상대적이기 때문에 특정 입력 백분율 값을 맞추려 시도하지 않는 것이 가장 좋으며, 이상적으로는 IgG 값이 표준 곡선에서 가장 희석된 샘플에 가장 가까운 Ct 값을 가져야 합니다. 다시 말해, ChIP은 상대적이므로 ChIP 신호가 IgG 신호보다 높다면(분석법 변동 범위 내에서) ChIP 결과가 양성입니다.
   
   
7. 양호한 ChIP DNA 농축 배수는 어떻게 판단하나요?
   이는 표적 단백질에 따라 달라집니다. 풍부한 표적은 희소한 표적에 비해 높은 농축도를 보일 가능성이 높습니다. 일부 연구실에서는 성공적인 실험의 최소 기준으로 IgG 대조군 대비 5배 이상의 농축 배수를 설정하기도 합니다. 그러나 특정 값에 맞추기보다는 발표된 결과와 비교하는 것이 가장 좋습니다.
   
   
8. qPCR 프라이머를 어떻게 테스트하나요? 알려진 농도의 적절한 샘플을 연속적으로 희석하여
   qPCR 반응을 실행함으로써 프라이머를 테스트할 수 있습니다. 프라이머가 최적의 상태로 작동하고 반응의 다른 모든 조건이 충족된다면, 사이클의 각 선형 단계에서 증폭 산물이 대략 두 배로 증가하는 것을 관찰할 수 있습니다(qPCR 및 데이터 분석 섹션 참조).
   
   
9. 단일 중합효소 연쇄반응(singleplex)과 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex) 중 어떤 방식을 선택해야 하나요? 다중 검사를
   수행할 때는 다중 중합효소 연쇄반응이 더 적합할 수 있으나, 반응 튜브 내 각 표적 DNA에 대해 명확한 형광 신호를 생성할 수 있는 형광표지 프로브와 같은 복잡한 검출 방법이 필요합니다. 따라서 각 프라이머-프로브 세트에 대한 최적화가 필요하며 추가 비용이 발생할 수 있습니다. 싱글플렉스 실험은 설계가 비교적 용이하며, SYBR^® Green과 같은 비용 효율적인 DNA 결합 염료와 적절히 설계된 프라이머를 사용하여 여러 샘플을 병렬로 실행할 수 있습니다(qPCR 및 데이터 분석 섹션 참조).
   
   
10. SYBR^® Green의 비특이적 결합과 핵산 오염물을 어떻게 구분할 수 있나요? qPCR 과정의 열 조건을 조작하여 증폭 산물이
    용융되도록 하는 용융 곡선 분석을 수행할 수 있습니다. 표적 증폭 산물에 대해서는 용융 곡선에서 단일 피크만 관찰되어야 합니다. 추가 피크는 프라이머 다이머나 오염물의 존재를 나타낼 수 있습니다.