BPA가 없는 배양 배지를 위한 초순수
본 연구의 목적은 물에 함유된 저농도 내분비 교란 물질 비스페놀 A(BPA)를 검출하는 기술을 확립하고, Biopak® 울트라필터가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 정제수 시스템(분자생물학 응용분야에 권장하는 구성)이 BPA에 민감한 발생학 연구에 적합한 기준의 초순수를 어떻게 생산하는지를 문서화하는 데 있습니다.
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비스페놀 A와 같은 내분비 교란 물질로 인한 건강 문제
내분비 교란 물질은 인간과 동물의 내분비계를 간섭하는 화학물질입니다. 이 물질은 생식, 면역 및 신경계뿐만 아니라 성장에도 영향을 미쳐 건강에 부정적인 결과를 초래합니다. 내분비 교란 물질은 플라스틱(실험실 소모품 및 장비를 포함), 광택제, 수지, 표면활성물질에서도 존재하는 등 어디에나 있습니다.
규범과 표준을 통해 환경은 물론 식료품 및 음료에 함유된 내분비 교란 물질의 최대 용량을 규제합니다. BPA는 산업적으로 생산된 다양한 내분비 교란 물질 중에서 가장 광범위하게 퍼져 있는 물질 중 하나입니다. BPA는 에스트로겐 호르몬을 흉내내므로 ‘제노에스트로겐’으로 알려져 있으며 주요 건강 문제를 일으킵니다. 몇몇 연구에서 BPA가 호르몬 생산과 호르몬의 유전자 발현을 방해하는 것이 확인되었습니다. 최근 연구에서는 심지어 낮은 수준의 BPA(20µg/kg/일, 1주일 동안 태아 노출 시 환경적으로 연관된 BPA 양에 해당함) 조차 난소 내에서 난모세포가 성장하는 것을 방해함으로써 건강한 난모세포 생산에 영향을 미칠 수 있다(그림 1)는 것이 밝혀졌습니다.1-3
아래에 기술된 이 연구의 목표는 Milli-Q® 정제수 시스템으로 얻은 초순수(Type 1)의 품질이 BPA가 없음을 보장하는 배지 및 솔루션, 특히 번식생물학 실험을 위한 BPA-free 배양 환경을 준비하는 데 적절하다는 것을 입증하는 것이었습니다.
- 연구 1은 기체 크로마토그래피 질량 분석법과 결합된 고성능 고체상 미세추출법을 사용하여(HP-SPME-GC-MS) 각기 다른 유형의 물에서 수행한 BPA 분석 결과를 보여줍니다.
- 연구 2는 난모세포 성숙에 BPA가 미치는 영향을 평가하기 위한 세포검사 분석 및 분자 분석의 결과를 나타냅니다.
- 연구 3은 세포 이미징 기술에서 사용되는 배양 배지용 물의 중요성을 보여줍니다.
그림 1.감수분열 중기 II(MII) 동안 마우스 난모세포의 현미경적 면역세포화학 분석. 감수분열 방추(빨간색) 및 중심체(녹색)에 있는 단백질에 대한 항체를 이용함. 염색체는 DAPI(파란색)로 대조염색되었습니다.
연구 1: 발생학 연구에 사용되는 초순수에서 BPA를 측정하기 위한 HP-SPME-GC-MS
번식생물학에서 물은 분석을 수행하는데 사용되는 핵심 시약입니다(예, 배양 배지 준비).
이탈리아 파비아 대학교의 연구자들은 재현성 있는 HP-SPME-GC-MS 방법을 사용하여 발생학 연구에서 사용된 초순수의 BPA 함유량을 분석하였습니다. Milli-Q® HX 정제수 시스템과 유사하게 진보된 역삼투압(RO), Elix® 전기탈이온화(EDI) 시스템, 살균 UV 램프를 포함하는 정제 기술을 조합하여 이용하는 시스템에서 생산된 Elix® 순수가 공급되는 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템에서 분석 대상 초순수를 얻었습니다. 사용 시점에 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템은 Biopak® 폴리셔와 함께 구비되어 있었습니다(그림 2). Biopak® 한외여과 폴리셔는 내독소, 뉴클레아제, 프로테아제, 박테리아가 없는 물을 공급해야 하는 분자생물학 응용분야에 권장됩니다.
그림 2.HP-SPME-GC-MS를 이용한 각기 다른 유형의 실험용수 내 비스페놀 A(BPA)에 대한 실험실 분석 개요.
HP-SPME-GC-MS 분석은 검출 한계(LOD) 4 nM 이내인 경우, 실험실 실험에 공급하기 위해 사용된 Elix® 순수와 Milli-Q® 초순수 모두에서 BPA를 검출할 수 없었다는 것을 보여줍니다(표 1).
이미 언급했듯이, 실험용 물은 Biopak® 폴리셔에서 채수되었습니다. 그림 3은 Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 시스템에서 사용 시점에 연속적으로 채수한 3종의 물 시료를 분석하여 얻은 일반적인 결과를 보여줍니다. 아래의 재료 및 방법 섹션에 기술된 과정에 따라 매일의 BPA 변동성뿐만 아니라 GC-MS 분석의 반복성 및 견고성 또한 평가되었습니다.
결과는 Milli-Q® IQ 7000 시스템에서 얻은 초순수 품질이 검출 가능한 BPA를 함유하지 않는다는 것을 입증합니다(LOD = 4 nM). 특히 정제수 시스템에 공급되는 수돗물에서 BPA를 검출할 수 없었기 때문에, 해당 분석은 BPA가 시스템으로부터 생산된 물로 침출되지 않는다는 것을 보여주었습니다.
그림 3.3개의 초순수 시료에서 BPA 수준을 보여주는 크로마토그램 시료는 Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템 사용 시점에 연속적으로 채수되었습니다.
다음 두 연구는 Milli-Q® 초순수 시스템을 사용하여 확신을 갖고 BPA 오염이 없는 고품질 정제수를 채수할 수 있으며 내분비 교란 물질이 발달 중인 생식세포 및 배아에 미치는 영향의 연구에서 해당 시스템을 추가로 사용할 수 있다는 것을 보여줍니다. 특히 Biopak® 폴리셔 처리 후 채수된 물의 경우 더욱 사용 가능합니다.
연구 2: 난모세포 성숙에 미치는 BPA의 영향을 평가하기 위한 세포검사 분석 및 분자 분석용 BPA-free 초순수
특정 분자의 영향을 측정할 때 실험실 환경에는 관심 대상 분자가 존재해서는 안됩니다. 발표된 연구에서, 연구자들은 4개의 모계 영향 유전자인 Brg1(염색질 리모델러), Dnmt3a 및 Dnmt3l(DNA 메틸화효소), 그리고 Oct-4(세포 만능성 마커)의 전사 발현을 분석하기 위해 qRT-PCR을 사용하였습니다. 시료는 10개의 중기 II(MII) 마우스 난모세포로 된 3개의 독립적인 급원으로 구성되었으며, 완전 성숙 포강 난모세포를 10 nM, 100 nM 또는 1,000 nM 농도의 BPA가 존재하는 환경에서 15시간 동안 체외 성숙(IVM)시킨 후 획득되었습니다.
대부분(96.5%)의 난모세포가 대조군(CTR) 및 노출된 시료 간에 유의차 없이 MII 단계에 도달하였으므로, 실험결과는 3개의 실험군 농도에서 BPA가 감수분열 난자성숙을 정지시키지 않는다는 것을 보여주었습니다. 하지만 10 nM BPA에서 변화가 없는 Oct-4를 제외한 실험을 시행한 나머지 모든 유전자의 발현이 모든 BPA 실험 농도에서 의미있게 변화되었습니다(높은 농도 또는 낮은 농도를 처치하지 않은 대조군과 비교 시)(그림 4).
이러한 유전자 발현 실험은 Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 정제수 시스템에서 채수한 초순수를 이용하여 수행되었습니다. 실험결과는 Milli-Q® 시스템에서 채수한 초순수가 BPA에 민감한 번식생물학 응용분야에서 사용하기에 적합하다는 것을 뒷받침합니다.
그림 4.GV-to-MII 이행 동안 10, 100 또는 1,000 nM BPA에 노출된 마우스 난모세포에서 Brg1, Dnmt3a, Dnmt3l 및 Oct-4 모계 영향 유전자의 발현 프로파일. 대조군(CTR) 시료의 발현 값은 n배수 변화 계산을 위해 1로 설정되었습니다. 값은 평균±표준편자로 표현됩니다. *p < 0.05 **p < 0.001.
연구 3: 세포 이미징 기술에 사용되는 배지를 위한 BPA-free 초순수
타임랩스 이미징으로 배소포(GV)에서 MII 단계로 발달하는 이행이 일어나는 동안 난모세포 내부에서 발생하는 이동을 관찰할 수 있습니다(동영상4). 이러한 이동은 세포질 이동 속도(CMV)로 알려져 있으며, 여성 생식세포 발달 능력(이후 발달을 지속할 수 있는 생식세포의 품질 및 능력)을 평가하는 비침습 세포학적 마커의 역할을 합니다.5,6 보고된 연구에서, 이런 새로운 기술은 BPA 농도가 없거나 또는 증가하는 상황에서 성숙한 난모세포가 GV-to-MII 이행 동안 발생하는 CMV를 조사하는데 사용되어 왔습니다(그림 5는 100 nM BPA에 대한 데이터만 보여줍니다).
세포 입자영상유속(세포 PIV) 분석은 난모세포가 실험에서 BPA 양에 민감했던 특정한 발달 시간대를 보여줍니다. 놀랍게도, 낮은 10 nM BPA 농도에 노출되었을 때는 CMV의 변화가 한 시점에서 분산되었지만, 더 높은 용량에서는 GV-to-MI 이행 중에 늘어난 타임랩스 동안 CMV의 변화가 관찰되었습니다. 특히, 100 nM BPA는 염색질이 응축되고 동원체가 큰 염색질 뭉치로 뭉쳐서 MI 중기판을 형성하는 시간 간격 내에 유의차를 보여주었습니다(그림 5).
상기의 CMV 실험에서 사용된 배양 배지는 Biopak® 폴리셔를 장착한 Milli-Q® IQ 7000 정제수 시스템에서 공급되는 초순수를 사용하여 조제되었습니다. 실험 결과는 유전자발현이나 세포질 운동 분석을 하는 동안 검출된 낮은 100 nM 농도의 BPA라 하더라도 영향을 미칠 수 있으므로 BPA-free 배양 배지의 필요성을 강조합니다.
그림 5.(A) 프레임 1(a)에서 촬영된 GV 난모세포와 프레임 100(b)에서 촬영된 MII 난모세포의 대표 이미지 삽화는 세포질 이동 강도와 방향을 가리키는 화살표(속도 벡터)가 포함된 확대 이미지를 보여줍니다. 화살표의 색깔과 길이는 이전 프레임과 비교했을 때의 이동 속도 모듈을 가리킵니다. 색깔이 있는 축척 막대(nm/분): 파란색은 느린 속도; 보라색은 빠른 속도. 막대: 10 μm. (B) 100nM BPA가 없거나(녹색) 존재할 때(회색) 마우스 난모세포의 GV-to-MII 이행 동안 세포질 이동 프로파일 *p < 0.05.
결론: 배아발생 연구에서 BPA에 민감한 응용분야를 위한 초순수
연구 기술의 민감도와 성능이 증가함에 따라 실험 결과의 정확성 및 인증성을 훼손할 수 있는 오염을 예방하는 고품질 정제수가 요구됩니다. 특히 고도로 획기적인 조사 도구를 사용하는 연구에서 연구자들은 실험 결과를 교란할 수 있는 모든 문제(예, BPA, 내독소, 핵산분해효소, 단백분해효소 및 박테리아)를 예방할 수 있으며 실험 분석에 높은 확신을 줄 수 있는 고순도의 물을 요구합니다.
발생학 분야에서는 심지어 낮은 수준의 내분비 교란 물질 BPA조차 난모세포 성장을 방해하므로 배아발생 연구를 위태롭게 하는 것으로 입증되었습니다. BPA는 실험실에 공급되는 수돗물에 항상 존재하는 것은 아님에도 불구하고 실험실 소모품 및 장비에서 침출될 수 있어 실험 결과에 간섭하는 원인이 되므로 문제가 됩니다.
이 논문에서 낮은 BPA 농도는 감수분열 성숙을 막지 않는다는 것을 확인하긴 했지만, 10 nM이라는 아주 낮은 BPA 농도조차 배소포(GV)에서 MII 발달 단계로 이행하는 동안 난모세포 내부에서 발생하는 유전자발현과 이동 모두에 영향을 미쳤습니다. 이 실험결과는 BPA가 검출되지 않는 수준이라고 확인할 수 있는 초순수 사용을 포함하여 BPA-free 환경에서 발생학 실험을 수행할 필요성을 강조합니다.
Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템에서 생산된 초순수는 이 논문에서 사용된 방법에 따라 4 nM에 불과한 매우 낮은 검출 한계에서조차 검출 가능한 BPA를 포함하지 않는 것으로 나타났습니다. 그러므로 이 시스템이 제공하는 초순수는 발달 중인 생식세포 및 배아에 대한 내분비 교란 물질의 영향을 연구할 때 확신을 가지고 사용할 수 있습니다.
BPA에 민감한 분석의 요구 사항을 충족하는 정제수 솔루션을 찾으려면 실험용 정제수 전문가에게 지원을 요청하십시오.
BPA의 HP-SPME-GC-MS 분석을 위한 재료와 방법
기기
- CombiPAL 자동시료주입기(CTC Analytics, 스위스)가 장착된 Thermo Scientific DSQII 단일 사중극자 GC/MS 시스템(TraceDSQII 질량분석기, TraceGCUltra 기체 크로마토그래피)을 물 분석 수행 시에 사용하였습니다.
- 길이 30 mm, 내경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 µm인 Restek RxiTM - 5ms 모세관 컬럼(5% 다이페닐/95% 다이메틸 폴리실란 – Restek Corporation, 미국 벨폰트)을 운반 기체인 헬륨과 함께 1.0 mL/분의 일정한 유량으로 사용했습니다.
- 100 µm 폴리다이메틸실록산(PDMS) SPME 섬유 어셈블리를 사용하였습니다. 이전 분석의 재료가 남아있지 않도록 각 분석 20분 전에 니들 히터(needle heater) 내에서 250°C로 섬유를 세척하였습니다.
표준 준비
10 nM 농도의 BPA 저장용액은 100% 에탄올에 준비했습니다. 일련의 희석은 검량선을 얻기 위해 HPLC water를 사용하여 4개의 각기 다른 농도 수준인 1, 2, 4, 40 nmol/L로 만들어졌습니다.
실험 1: GC-MS 분석의 반복성 및 견고성 평가
세 종류의 물 시료(5 mL)는 각기 다른 세 종류 출처인 수돗물, Elix® 순수 및 Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템 사용 시점에 연속하여 채취되었습니다. 채취 전, 시스템을 씻어 내리기 위해 물 5 L를 채수하였습니다.
실험 2: BPA 농도의 일상적 변화 평가
세 종류의 물 시료(5 mL)는 3일 간 24시간 마다 세 종류 출처인 수돗물, Elix® 순수 및 Biopak® 폴리셔가 장착된 Milli-Q® IQ 7000 초순수 시스템 사용 시점에 채취되었습니다. 채취 전, 물 5 L를 채수하였습니다. 크로마토그램은 요청 시 즉시 제공됩니다.
물 시료
분석할 물(수돗물, Elix® 순수 및 Biopak® 필터를 거친 초순수를 뜻함) 5 mL 부피를 20 mL 유리 바이알에 추가했습니다. 각 바이알마다, KHCO3 200 mg, NaCl 1 g 및 일회용 자석 교반 막대를 추가했습니다.
유도체화
아세트산 무수물 30 µL를 물 시료에 추가하고 바이알을 폴리테트라플루오로에틸렌이 대어져 있는 셉텀과 헤드 스페이스 알루미늄 캡으로 밀봉했습니다. 완전한 반응은 80°C에서 5분의 유도체화 반응시간(동시에 50 rpm으로 지속적으로 휘저음)으로 획득하였습니다. BPA의 헤드 스페이스 추출은 100 µm PDMS 섬유를 이용하여 80°C에서 30분간 휘저으면서(500 rpm) 수행되었습니다. SPME 섬유는 250°C에서 2분 동안 주입기 내에서 탈착되었습니다.
크로마토그래피 분석
오븐 온도는 150°C에서 2분간 유지되었으며 30°C/분의 속도로 280°C까지 증가시켜 6분간 유지하였습니다. 주입은 비분할 모드에서 수행되었으며 비분할 시간은 2분이었고 PTV 주입기 온도는 250°C로 유지되었습니다. 열 전달통로는 290°C, 이온 소스는 250°C로 유지되었습니다. 질량분석기(MS)는 전자 충격 이온화(EI) 모드에서 작동되었으며 이온은 질량 범위 m/z 35~350 amu의 전체 스캔 모드와 BPA를 위한 정성이온으로, m/z 270을 이용한 SIM(선택적 모니터링) 모드 둘 다에 등록되었습니다.
감사의 말
저자들은 본 연구를 수행해 준 파비아 대학교(이탈리아)의 발생생물학 실험실과 이 프로젝트에 기여한 R&D 동료들에게 감사드립니다.