Protocole PCR standard
Comment réaliser une PCR
Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) standard se déroule en quatre étapes :
- Ajouter les réactifs nécessaires ou le mastermix et la matrice dans les tubes PCR.
- Mélanger et centrifuger.
*Ajouter de l'huile minérale pour empêcher l'évaporation dans un thermocycleur sans couvercle chauffant. - Amplifier selon les paramètres du thermocycleur et des amorces.
- Évaluer l'ADN amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose suivie d'une coloration au bromure d'éthidium.
Ces étapes sont présentées ci-dessous de manière plus détaillée, accompagnées de conseils pour le choix du matériel et des réactifs. Il s'agit d'un protocole de PCR de base utilisant la Taq ADN polymérase.
Étapes de la PCR et composants essentiels de la PCR
Le dépannage d'une réaction PCR implique de nombreux facteurs. Regardez cette animation pour découvrir comment le choix des composants et des conditions de cycle adaptés à vos besoins peut vous aider à obtenir des résultats optimaux.
Vous trouverez d'autres protocoles concernant d'autres polymérases ou des techniques de PCR avancées dans la section « Protocoles » de notre Guide des technologies PCR.
Pour en savoir plus sur la PCR standard, notamment sur ce qu'elle est, consultez notre page « Notions de base sur la PCR ».
Réactifs : de quoi a-t-on besoin pour la PCR ?
Qu'est-ce que la Taq polymérase ?
La Taq ADN polymérase est une enzyme thermostable issue de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Elle est couramment utilisée pour amplifier des fragments d’ADN par PCR. L’enzyme se présente sous forme recombinante, exprimée dans E. coli. Elle est capable de résister à des cycles répétés de chauffage à 95 °C (comme l’exige la technique de la PCR) sans perte significative d’activité. L'enzyme présente un poids moléculaire d'environ 94 kDa par SDS-PAGE et ne présente aucune activité endonucléase ou exonucléase détectable. Elle possède une activité ADN polymérase 5'→3' et une activité exonucléase 5'→3'. Chaque lot de Taq ADN polymérase est testé pour l’amplification par PCR et le séquençage double brin. L’enzyme est fournie à une concentration de 5 unités/µL et est accompagnée d’un tampon de réaction 10x optimisé.
ADN polymérase Taq standard
Utilisez le tableau ci-dessous pour sélectionner un mélange de Taq ADN polymérase adapté à vos conditions de réaction. Choisissez parmi des formulations transparentes ou colorées en rouge, avec ou sans chlorure de magnésium (MgCl₂), ou optez pour un mélange prêt à l'emploi ou un master mix contenant un tampon et des dNTP.
Définition de l'unité : Une unité correspond à l'incorporation de 10 nmol de désoxyribonucléosides triphosphates totaux dans de l'ADN précipitable par acide en 30 minutes à 74 °C.
Procédure : étapes de la PCR
Les conditions optimales concernant la concentration de la Taq ADN polymérase, de l’ADN matrice, des amorces et du MgCl₂ dépendent du système utilisé. Il peut s’avérer nécessaire de déterminer les conditions optimales pour chaque composant individuellement. Cela vaut tout particulièrement pour la Taq ADN polymérase, les paramètres de cycle et la concentration en MgCl₂. Il est recommandé de titrer l’enzyme et le MgCl₂ afin de déterminer le rendement optimal.
- Ajouter les réactifs dans un tube de taille appropriée, dans l’ordre indiqué dans le tableau. (Sélectionner le tableau correspondant à la configuration de la réaction : réactifs standard ou prêt à l’emploi.) Pour un grand nombre de réactions, il convient de préparer un mastermix sans matrice, puis de le répartir en aliquotes dans des tubes de réaction. À la fin, la matrice doit être ajoutée aux tubes appropriés.
Réaction PCR standard
*Achetez le tampon et la Taq polymérase ensemble : D1806, D4309 ou D4545
Réaction PCR prête à l'emploi
2. Mélanger délicatement à l'aide d'un vortex, puis centrifuger brièvement afin de rassembler tous les composants au fond du tube.
Remarque : ajouter 50 µL d’huile minérale au sommet de chaque tube pour empêcher l’évaporation si vous utilisez un thermocycleur sans couvercle chauffant.
3. Procéder à l’amplification. Les paramètres d’amplification varient en fonction des amorces et du thermocycleur utilisés. Il peut s’avérer nécessaire d’optimiser le système pour chaque amorce, chaque matrice et chaque thermocycleur.
Paramètres de cyclage types
Il est recommandé d'effectuer 25 à 30 cycles d'amplification.
4. L'ADN amplifié peut être analysé par électrophorèse sur gel d'agarose, suivie d'une coloration au bromure d'éthidium.
Remarque : la couche d'huile minérale peut être éliminée par une seule extraction au chloroforme (1:1), en récupérant la phase aqueuse.
Réactifs pour l'électrophorèse des acides nucléiques
- Agarose (gels préfabriqués, poudre, etc.)
- Tampon tel que MOPS-EDTA-acétate de sodium, tris-acétate-EDTA (TAE) ou tris-borate-EDTA (TBE)
- Solution de chargement du gel et tampon de chargement des échantillons pour l’ARN
- Colorant d’électrophorèse tel que le bromure d’éthidium
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