Dépannage en cas de contamination des cultures cellulaires
Aperçu
Types de contamination
Causes courantes et prévention des contaminants
Contamination microbienne (bactéries, champignons, levures)
Mycoplasmes
Contamination
virale Contamination
chimique Conseils et techniques
généraux Travailler dans une enceinte
de sécurité biologique Pipetage et prévention des aérosols
Désinfection
Comment effectuer un suivi de routine des cellules saines
Contamination des cultures cellulaires : aperçu
général
Bien que l'expression « contamination des cultures cellulaires » évoque généralement la présence de bactéries parmi les cellules et des milieux troubles, les intrus indésirables dans les flacons de culture peuvent prendre de nombreuses formes. Les contaminants viraux et chimiques peuvent également avoir des conséquences considérables sur la santé des cultures, et il est essentiel de s'assurer que les lignées cellulaires ne font pas l'objet d'une contamination croisée pour garantir la reproductibilité des résultats.
Quelle est l’ampleur de la contamination cellulaire ? D’après des études menées par la FDA, l’ATCC et d’autres organismes, on estime qu’entre 5 et 30 % de toutes les cultures cellulaires actuelles sont contaminées par des espèces de mycoplasmes à elles seules. L’incidence de la contamination virale des lignées cellulaires courantes a dépassé 25 % dans une étude5, et les virus non cytopathogènes sont encore plus susceptibles que les mycoplasmes d’échapper à la détection, car l’état de la culture ne fournit pas toujours d’indices permettant de détecter leur présence.
Figure 1.Contamination cellulaire
La clé pour maîtriser un contaminant spécifique réside parfois dans la facilité avec laquelle il est détecté. Les contaminants bactériens, fongiques et levuriens sont souvent visibles à l’œil nu et peuvent rapidement tuer les cellules en culture, mais une morphologie subtile peut rendre plus difficiles à identifier des intrus microbiens importants tels que les mycoplasmes. En comparaison, les virus ne peuvent absolument pas être détectés par microscopie optique classique, et leur découverte est donc souvent déclenchée par l’observation d’un détachement inexpliqué ou d’autres signes de mauvaise santé cellulaire, voire de mort cellulaire.
L’une des préoccupations majeures auxquelles est confrontée la communauté biologique ces dernières années est la contamination, voire l’erreur d’identification pure et simple, des lignées cellulaires utilisées dans la recherche. Pour en savoir plus sur ce sujet important, cliquez ici afin de comprendre les causes et la prévalence de la contamination croisée des lignées cellulaires, ainsi que la manière d’évaluer l’intégrité de l’identité d’une lignée cellulaire.
Les contaminations bactériennes, fongiques (y compris les moisissures) et par des levures sont généralement visibles à l'œil nu sous la forme d'une turbidité d'apparition rapide et d'un changement de couleur du milieu de culture (à condition que celui-ci soit enrichi en rouge de phénol, l'indicateur de pH non toxique le plus courant). La microscopie optique standard permet également de mettre en évidence les cellules bactériennes et les structures fongiques ; ainsi, une observation microscopique quotidienne des cultures garantira une détection précoce de toute contamination microbienne et permettra de prendre les mesures appropriées dès l’apparition des premiers signes. Il est notamment nécessaire de retirer rapidement les cultures contaminées afin de protéger les cultures voisines, ainsi que l’environnement stérile de culture tissulaire, notamment les incubateurs, les bains-marie et l’enceinte de biosécurité. De plus, des tests spécifiques de dépistage des bactéries et des champignons doivent être intégrés à une procédure de contrôle qualité systématique et régulière.
Causes courantes et prévention de la contamination microbienne
Les mycoplasmes constituent un genre de bactéries dépourvues de paroi cellulaire ; ils ne sont donc pas sensibles aux antibiotiques qui limitent la croissance bactérienne en inhibant la formation de la paroi cellulaire. En raison de leur morphologie flexible et de leur taille cellulaire comprise entre 0,15 et 0,3 µm, ils peuvent échapper aux méthodes standard de filtration utilisées en culture cellulaire, qui recourent souvent à des filtres dotés de pores de 0,22 µm. Contrairement à la plupart des autres contaminants bactériens, les mycoplasmes ne sont pas visibles à l'œil nu et sont difficiles à détecter au microscope optique en raison de leur morphologie et de leur taille particulièrement réduite. La concentration en mycoplasmes dans une culture peut atteindre 10⁸ organismes/mL sans provoquer de turbidité du milieu. Ils ne tuent généralement pas les cellules mammifères qu’ils infectent, mais ont un impact significatif sur les cultures en altérant le métabolisme cellulaire, en provoquant des aberrations chromosomiques, en ralentissant la croissance cellulaire et en interférant avec l’adhésion cellulaire. En résumé, ils sont susceptibles d’influencer considérablement les résultats de la plupart des expériences réalisées à l’aide de lignées cellulaires contaminées.
Figure 2.Les agents de détection de l'ADN couramment utilisés, tels que le DAPI ou le Hoechst, permettent de mettre en évidence la présence de mycoplasmes dans des cultures contaminées (à droite) grâce à la microscopie à fluorescence.
La diversité des sources de contamination par les mycoplasmes en laboratoire peut constituer un véritable défi. Certaines espèces de mycoplasmes étant présentes sur la peau humaine, elles peuvent être introduites en raison d’une technique d’asepsie défaillante, mais aussi par le biais de compléments contaminés tels que le sérum fœtal bovin. Les mycoplasmes se transmettent très facilement entre des cultures cellulaires contaminées voisines. Pour traiter les mycoplasmes, il est nécessaire de filtrer les milieux et les tampons à l'aide de membranes dont les pores mesurent 0,1 µm ou moins, car les dispositifs de filtration standard pour milieux, dont les pores mesurent 0,22 ou 0,45 µm, ne parviennent pas à retenir ces petits organismes.
Prévention, détection et élimination de la contamination par les mycoplasmes
Une fois qu’un mycoplasme a contaminé une culture, il peut se propager rapidement à d’autres zones du laboratoire. Le respect strict des bonnes pratiques de laboratoire est essentiel, et la réalisation de tests de dépistage de routine est vivement recommandée pour lutter efficacement contre la contamination par les mycoplasmes. Les trois méthodes de détection les plus courantes sont la culture de mycoplasmes, la méthode de coloration de l’ADN et la détection par PCR. Nous proposons diverses solutions pour la détection et l’élimination des mycoplasmes. Il est essentiel de mettre en place un protocole de dépistage systématique des mycoplasmes dans les cultures, même si vous ne soupçonnez pas la présence de ce contaminant dans le laboratoire.
Prévenir la contamination microbienne : les antibiotiques sont-ils la solution ? L’une des pratiques courantes en culture tissulaire est l’utilisation systématique d’antibiotiques, seuls ou en association avec des antifongiques. Tout comme pour les antibiotiques thérapeutiques prescrits par les médecins, l’utilisation continue ou inappropriée d’antibiotiques peut entraîner l’apparition de souches résistantes difficiles à éradiquer et nécessiter le recours à des antibiotiques de nouvelle génération pouvant s’avérer toxiques pour les cultures cellulaires. Des études récentes ont soulevé des inquiétudes supplémentaires quant au risque d’altération de l’expression génique dans les cellules en culture en présence d’antibiotiques. |
Contamination virale
Les virus comptent parmi les contaminants les plus difficiles à détecter dans les cultures cellulaires, ce qui nécessite des méthodes d’observation au microscope qui ne seraient pas envisageables pour la plupart des laboratoires de recherche. Ils peuvent provenir du patient ou de l’animal hôte dont les cellules sont issues, et il a été démontré que plusieurs lignées cellulaires d’importance biotechnologique contiennent des rétrovirus endogènes. Le plus souvent, les cellules sont infectées par des virus présents dans les matériaux d’origine animale utilisés pour leur culture. La petite taille des virus rend leur élimination très difficile des milieux de culture, des sérums et autres solutions d’origine biologique. Cependant, comme la plupart des virus sont spécifiques à un hôte, voire à un tissu, cela peut limiter leur capacité à provoquer des infections inter-espèces ou inter-tissulaires. Bien que les virus puissent être plus courants dans les cultures cellulaires que ne le pensent de nombreux chercheurs, ils peuvent ou non constituer un facteur de confusion significatif pour la culture cellulaire s’ils n’induisent pas d’effets cytopathiques ou d’autres effets indésirables sur les cellules.
Au-delà de leur impact potentiel sur les cellules en culture, l’utilisation de cultures cellulaires infectées par des virus soulève une préoccupation majeure liée au risque sanitaire qu’elles représentent pour le personnel de laboratoire. Des précautions de sécurité particulières doivent toujours être prises lors de la manipulation de tissus ou de cellules provenant d’êtres humains ou d’autres primates afin d’éviter toute transmission potentielle d’infections virales (VIH, hépatite B, virus d’Epstein-Barr, virus de l’herpès simien B, entre autres) des cultures cellulaires au personnel de laboratoire. Il convient de consulter les responsables institutionnels de la sécurité environnementale concernant les procédures à suivre pour manipuler des tissus, des cultures ou des virus potentiellement dangereux. Pour en savoir plus sur l’évaluation des risques pour le personnel de laboratoire travaillant avec des cultures cellulaires, cliquez ici
Meilleures pratiques pour réduire l’incidence de la contamination virale des cultures cellulaires :
*Limiter le nombre de sources biologiques (fournisseurs, animaux) à partir desquelles les cellules sont prélevées.
*Sélectionner des animaux/cellules moins sensibles aux virus.
*Se procurer les cellules auprès de banques qui effectuent des tests de dépistage viral et fournissent une certification attestant que les lignées cellulaires sont exemptes de virus.
Contamination chimique
Tout contaminant non vivant d’une culture cellulaire est souvent classé comme un contaminant « chimique ». Ces contaminants peuvent provenir des réactifs ou de l’eau utilisés dans les milieux de culture ou les tampons, ou encore du matériel et des consommables. Il s’agit par exemple des radicaux libres, des ions métalliques, des résidus de désinfectants ou de détergents, voire des endotoxines qui persistent après la disparition des contaminants bactériens en amont.
Conseils pour prévenir la contamination chimique :
*Utilisez toujours de l’eau de qualité laboratoire pour préparer les tampons et les solutions, ainsi que pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés.
*Tout matériel de laboratoire réutilisable doit être rincé minutieusement et séché à l’air libre — l’autoclavage n’aura aucun effet sur les résidus de détergent.
*Procurez-vous les milieux de culture, les suppléments et le sérum (FBS, FCS) exclusivement auprès de fournisseurs fournissant une attestation de test d’endotoxines.
Conseils généraux et techniques pour prévenir et éliminer la contamination
Travailler à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique
Lorsqu’on travaille à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, il est utile de garder à l’esprit que la circulation de l’air est essentielle au maintien d’un environnement stérile. Les évents arrière et avant doivent être maintenus dégagés en permanence afin d’assurer une circulation d’air efficace. Avant toute manipulation, l’enceinte doit être approvisionnée en tout le matériel nécessaire afin de minimiser le risque de transfert de contaminants par les manches et les mains de l’opérateur.
Il faut attendre au moins vingt minutes après le démarrage de la ventilation avant de placer les objets destinés à être utilisés dans l’enceinte. Tous les objets qui entrent dans l’enceinte doivent d’abord être vaporisés d’alcool stérile à 70 % (v/v) et essuyés avec des lingettes non pelucheuses afin d’empêcher la poussière et les particules de pénétrer dans l’enceinte. Assurez-vous que la ventilation est bien établie avant d’ouvrir tout couvercle ou récipient, afin de permettre à l’air de purger la zone de travail des particules qui auraient pu y être introduites.
Figure 3.Travailler dans une armoire de sécurité
Pipetage et prévention des aérosols
Les pipettes en plastique à usage unique — également appelées pipettes sérologiques, disponibles dans des capacités allant de 1 à 100 ml — sont des outils indispensables à la culture cellulaire. Elles doivent être emballées individuellement afin de garantir leur stérilité. Le respect des consignes suivantes permet de minimiser les risques de contamination et les risques liés à la sécurité lors du pipetage.
- Utilisez des aides au pipetage automatiques, en veillant à ce que chaque aide soit réservée à l’usage exclusif d’une seule enceinte de sécurité. Pour éviter toute contamination, démontez et désinfectez régulièrement les pièces de l’aide au pipetage. Veillez à ce que les filtres de l’aide au pipetage soient toujours disponibles en quantité suffisante et remplacés régulièrement.
- Utilisez des pipettes bouchées (bouchées à leur extrémité supérieure avec du coton) dans la mesure du possible, en particulier lors du transfert de milieu de culture. Évitez d’aspirer du liquide dans le bouchon de la pipette. Si le bouchon est accidentellement mouillé, remplacez immédiatement le filtre du dispositif d’aide au pipetage.
- Évitez tout contact avec la pipette sérologique en la déballant partiellement, en fixant l’embout au dispositif d’aide au pipetage, puis en retirant le manchon en papier.
- Pour éviter de générer des aérosols contaminants, ne créez pas de bulles dans le milieu ou dans la pipette.
Désinfection
Les méthodes conçues pour la désinfection/décontamination des déchets de culture, des plans de travail et des équipements doivent non seulement minimiser le risque de contamination, mais aussi être sans danger pour le personnel de laboratoire. Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, tel que des gants et des lunettes de protection, lorsque vous utilisez des désinfectants concentrés. Les gants choisis doivent offrir une protection contre la substance manipulée. Les tableaux fournis par les fabricants vous aideront à identifier les gants les mieux adaptés à une tâche donnée. Les principaux désinfectants se répartissent en plusieurs groupes, dont les avantages respectifs peuvent être résumés comme suit :
Hypochlorite de sodium ou eau de Javel
- Bon désinfectant à usage général
- Efficace contre les virus
- Corrosif pour les métaux — ne doit pas être utilisé sur des surfaces métalliques telles que les centrifugeuses
- Facilement inactivé par les matières organiques ; il convient donc de préparer fréquemment une solution fraîche
- Utiliser de l'eau de Javel du commerce pour préparer une solution à 10 % (v/v) destinée au traitement des eaux usées ou à la désinfection des surfaces
Alcool (par ex. éthanol, isopropanol)
- Concentrations efficaces : 70 % pour l'éthanol, 60 à 70 % pour l'isopropanol
- Efficace contre les bactéries. L’éthanol est efficace contre la plupart des virus, mais pas contre les virus sans enveloppe
- L'isopropanol n'est pas efficace contre les virus
- Les aldéhydes sont irritants et leur utilisation doit être limitée
Les désinfectants à base de composés phénoliques doivent être évités, car ils ne sont pas pris en charge dans le cadre du programme de révision de la directive européenne sur les produits biocides.
Comment effectuer un suivi régulier des cellules saines
La surveillance des cultures cellulaires constitue un aspect essentiel du travail quotidien en culture cellulaire. Ce tutoriel vous aidera à comprendre les principes fondamentaux de la surveillance de vos cellules, notamment à quoi ressemble une culture saine, la confluence cellulaire et les différentes phases de croissance d'une culture cellulaire. Cette vidéo vous présentera également les indicateurs courants d'une contamination bactérienne ou par des mycoplasmes.