다중 실시간 중합효소 연쇄반응

프로브 기반 화학 반응을 활용한 멀티플렉스 qPCR은 광범위한 최적화와 검증이 필요한 까다로운 응용 분야입니다.

다중 채널 Eppendorf^® Mastercycler^® ep realplex⁴ S 실시간 PCR 사이클러와 Kapa Biosystems의 KAPA PROBE FAST qPCR 키트를 함께 사용하면 광범위한 최적화 없이도 고성능의 빠른 다중 qPCR을 위한 업계 최고의 솔루션을 제공합니다.

소개

최근 멀티플렉스 PCR의 발전으로 단일 반응에서 여러 DNA 표적을 동시에 신속하게 식별, 유전자형 분석 및 정량화할 수 있게 되었습니다. 멀티플렉스 qPCR은 특히 유전자 발현 분석, SNP 유전자형 분석, 복제수 변이(CNV), 유전자 변형 생물체(GMO) 검출, 병원체 검출 및 약물 치료 효과 모니터링과 같은 응용 분야에 적합합니다.

멀티플렉스 qPCR의 장점으로는 처리량 증가, 반응 비용 절감, 제한된 시료 물질의 보존 등이 있습니다. 멀티플렉스 qPCR은 상당한 최적화가 필요하며, 멀티플렉싱 전에 개별 분석법을 검증해야 합니다. 프라이머 상보성을 피하고 각 표적 증폭물의 효율적인 증폭을 보장하기 위해서는 신중한 분석법 설계가 중요합니다.

멀티플렉스 qPCR은 다중 채널 검출이 가능한 장비와 멀티플렉스 형식에서 모든 증폭 산물의 높은 반응 효율을 유지할 수 있는 qPCR 시약이 필요합니다. Eppendorf^® Mastercycler^® ep realplex⁴ S 실시간 PCR 시스템은 초고속 펠티어 제어 열블록(가열 6°C/초, 냉각 4°C/초)을 특징으로 하여 40사이클 qPCR 반응을 1시간 미만에 완료할 수 있습니다. realplex⁴ 펠티어 장치는 또한 고성능 qPCR에 필수적인 정확한 온도 제어와 높은 블록 균일성을 보장합니다. 광학 모듈은 사전 선택 및 균등화된 96개의 LED 배열로 구성되어 모든 웰이 균일하게 여기되므로, 많은 기존 qPCR 기기에서 형광 신호를 정규화하는 데 사용되는 수동 기준 염료(예: ROX)가 필요하지 않습니다. 그 결과 수동 기준 염료에 일반적으로 사용되는 채널을 다중 분석에 사용할 수 있습니다. 또한 realplex⁴는 현재 사용 가능한 가장 민감하고 경제적인 검출 기술인 광전 증배관(PMT) 기술을 신호 검출에 활용합니다. Eppendorf^® Mastercycler^® ep realplex⁴ S는 4채널 시스템으로, 520/550/580/605 nm에 해당하는 방출 필터를 통해 완벽한 멀티플렉스 유연성을 제공합니다.

Kapa Biosystems의 KAPA PROBE FAST qPCR 키트는 서열 특이적 프로브 화학 물질을 사용하여 매우 민감하고 정확한 실시간 PCR을 위한 즉시 사용 가능한 마스터 믹스를 포함합니다. 이 키트는 TaqMan^®, FRET 프로브, 스콜피온 프로브, 분자 비콘 등 다양한 프로브 화학 물질과 호환됩니다. KAPA PROBE FAST qPCR 키트는 반응 효율과 재현성을 저하시키지 않으면서 고속 qPCR을 위해 특별히 제조되었습니다. 본 키트는 다용도로 최적화되어 유전자 발현, SNP 유전자형 분석, 멀티플렉싱 등 광범위한 응용 분야에 적합합니다. KAPA PROBE FAST qPCR 키트는 항체 기반 핫 스타트 기능을 제공하여 95°C에서 초기 활성화 유지 시간을 단축시킵니다. KAPA PROBE FAST를 사용한 PCR 프로토콜은 연장 시간을 줄여 반응 성능 저하 위험 없이 PCR 사이클 시간을 크게 단축할 수 있도록 설계되었습니다.

방법

반응 효율 저하 없이 고속 다중 qPCR 수행 능력을 입증하기 위해, 인간 게놈 DNA의 2배 희석 8단계(그림 1) 또는 4배 희석 4단계 시료를 단일(그림 2) 또는 이중(그림 3) 분석법과 고속 사이클링 프로토콜(초기 활성화 95°C 3분, 95°C에서 3초, 60°C에서 20초로 40회 반복). 증폭은 realplex⁴ S 실시간 PCR 시스템을 사용하여 광학 투명 열밀봉 필름이 부착된 풀스커트 Eppendorf^® Twin.tec 플레이트에서 수행되었습니다. 본 연구에서는 두 가지 가수분해 프로브 기반 qPCR 분석법을 사용하였다(표 1). Cal Fluor^® Gold 540 TaqMan 분석법의 염료 보정은 Biosearch Technologies의 설명에 따라 수행되었다.

각 분석법별로 별도로 수행한 결과(그림 2) 및 이중 반응(그림 3)의 로그 증폭 플롯과 표준 곡선은 다중 형식으로 인해 qPCR 반응의 사이클 임계값(C_T)이나 효율이 저하되지 않았음을 나타낸다. 단일 및 이중 반응에서 각각의 4단계 희석에 대한 평균 C_T 값 차이(ΔC_T)는 단일 반응과 이중 반응 간의 성능이 유사함을 나타낸다(표 2). realplex4 S 실시간 PCR 시스템에서 수행할 경우, 기존 느린 프로토콜(초기 활성화 95°C 10분, 95°C 15초 및 60°C 60초 40사이클) 대비 빠른 프로토콜은 56분의 시간 절감 효과를 제공합니다.