Clonage et expression

Vecteurs d'expression protéique

Les plasmides, ou vecteurs d’expression protéique, sont des fragments circulaires d’ADN qui contiennent de nombreux éléments fonctionnels permettant le clonage et l’expression de la protéine d’intérêt. Le choix du vecteur d’expression approprié dépend en partie du type de protéine, de l’organisme qui l’exprimera, ainsi que de l’application spécifique et des questions scientifiques que le chercheur souhaite aborder. La grande variété de vecteurs d’expression disponibles permet aux chercheurs de choisir les éléments de clonage, de sélection des clones et d’expression protéique les mieux adaptés à leur étude. Une fois la séquence génétique d’intérêt et le vecteur d’expression sélectionnés, les chercheurs utilisent généralement des nucléases pour couper le vecteur avec précision à des sites spécifiques, afin de permettre le clonage en phase de la séquence génétique d’intérêt et, à terme, son expression dans un organisme hôte. Il est important de noter que les chercheurs ont généralement recours à des cellules chimiquement compétentes et à la transformation bactérienne pour héberger les plasmides d’ADN recombinant, car ceux-ci sont stables lorsqu’ils sont conservés congelés à -70 °C.

Comment transfectier des cellules

La transfection cellulaire désigne le processus consistant à introduire de l’ADN, de l’ARN ou des protéines dans des cellules eucaryotes. Diverses technologies physiques, chimiques et biologiques sont à la disposition des chercheurs pour mener à bien cette étape du processus d’expression protéique. Les méthodes physiques, telles que l’électroporation, ou les méthodes chimiques, notamment les réactifs à base de phosphate de calcium (CaPi), de polyéthylèneimine (PEI) et de lipofection, sont toutes couramment utilisées par les chercheurs. Des systèmes de transduction virale, notamment lentiviraux, oncorétroviraux et adénoviraux, sont également à la disposition des scientifiques. Cependant, le recours à des méthodes de délivrance virales nécessite souvent des mesures supplémentaires de confinement et de surveillance pour des raisons de biosécurité.

Systèmes d’expression protéique

Les chercheurs utilisent divers organismes pour exprimer la protéine qui les intéresse. Les bactéries sont couramment utilisées par les chercheurs car elles intègrent efficacement les vecteurs d’expression, présentent des temps de doublement rapides et peuvent produire de grandes quantités de protéines recombinantes dans des conditions optimales. Cependant, les bactéries étant des organismes procaryotes, elles ne sont pas en mesure d’assurer les modifications post-traductionnelles dont certaines protéines ont besoin. Les cellules eucaryotes, notamment les levures et les lignées cellulaires mammifères, facilitent les modifications post-traductionnelles des protéines et sont également couramment utilisées par les chercheurs. Le choix de la meilleure lignée cellulaire pour l’expression de protéines recombinantes et de la stratégie d’expression dépend fortement des besoins spécifiques de l’application et des questions que le chercheur souhaite aborder.