Marquage et détection des acides nucléiques

Marquage des acides nucléiques et sondes

Les acides nucléiques peuvent être marqués sur toute la longueur de la molécule ou aux extrémités 5' et 3'. Les sondes d'acides nucléiques sont particulièrement utiles pour les tests d'hybridation, tels que la détection de l'ARN dans un Northern blot ou de l'ADN dans un Southern blot. Diverses méthodes de marquage sont utilisées pour répartir le marqueur sur toute la sonde, notamment la PCR avec des désoxynucléotides (dNTP) ou des nucléotides triphosphates (NTP) marqués, l’amorçage aléatoire et la traduction de nick. Le marquage terminal est particulièrement utile pour les tests étudiant les interactions acides nucléiques-protéines afin d’éviter les encombrements stériques.

Marquage des acides nucléiques et tests de détection

Selon la méthode de marquage, la détection colorimétrique est souvent utilisée pour les sondes marquées par des enzymes, tandis que la détection autoradiographique convient aux sondes radioactives. Parmi les sondes courantes, on trouve la digoxigénine (DIG) et les sondes marquées à la fluorescéine ; elles peuvent être utilisées en combinaison pour faciliter la détection multicolore des sondes lorsqu’elles sont associées à des réactions colorimétriques (par exemple, la phosphatase alcaline). De même, l’incorporation de Biotine-16-dUTP par PCR est également possible avec la plupart des ADN polymérases, ce qui constitue une méthode supplémentaire de marquage et de détection. L’hybridation in situ fluorescente (FISH) utilise des sondes fluorescentes pour détecter des séquences d’ADN ; le succès de la détection et de l’analyse en aval dépend en partie de la sensibilité et de la résolution du microscope à fluorescence dont dispose le chercheur.

Applications de l’ADN et de l’ARN marqués

Le transfert de macromolécules vers des membranes en phase solide est appelé « blotting ». En raison de la spécificité des sondes marquées, l’hybridation entre l’acide nucléique et la sonde permet aux chercheurs de détecter à la fois des séquences d’ADN et d’ARN dans des mélanges complexes d’acides nucléiques. De plus, ces méthodes permettent de recueillir des informations supplémentaires précieuses, notamment l’analyse de l’expression génique, de la taille de l’ARNm et du nombre de copies, en fonction du test utilisé. L’hybridation in situ est également couramment utilisée par les chercheurs pour détecter une ou plusieurs sondes marquées différemment (par exemple, des sondes marquées au DIG et à la fluorescéine).