Marquage et modification des protéines
Étape 1 : Étiquetage.Dissoudre la protéine dans le tampon. Ajouter le colorant et agiter pendant 2 heures.
Étape 2 : Purification.Équilibrer la colonne. Ajouter le mélange réactionnel, lancer la séparation. Récupérer la solution de protéine marquée purifiée.
Les protéines sont composées de chaînes polypeptidiques et leurs fonctions biologiques sont déterminées en partie par leur repliement correct, leur taille et le nombre de groupes fonctionnels réactifs présents le long de la chaîne polypeptidique. La possibilité d'apporter des modifications protéiques spécifiques à un site donné permet aux chercheurs d'étudier un large éventail de propriétés ainsi que leur fonction biologique globale. Les technologies de marquage et de modification des protéines comprennent l'ajout de fluorophores, de biotine et d'autres petites molécules afin d'étudier les interactions protéine-protéine, le repliement des protéines, la structure globale des protéines et leur fonction biologique.
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Marquage par protéines fluorescentes
La découverte et l’utilisation généralisée de la protéine fluorescente verte (GFP) constituent un exemple éloquent de cette technologie. La GFP et ses molécules homologues ont eu un impact considérable sur de nombreux domaines de recherche et sur notre compréhension des processus biologiques. Par exemple, l’incorporation de marqueurs fluorescents sur des anticorps permet la détection et la quantification de complexes protéiques hautement spécifiques dans les tissus, ou l’immobilisation directionnelle de complexes anticorps-protéines pour des applications ELISA et western blot. Cependant, l’utilisation de la GFP présente un inconvénient majeur : la fonction de la protéine peut être perturbée par l’incorporation de marqueurs protéiques supplémentaires de cette taille. Pour contourner cette difficulté, les chercheurs peuvent utiliser des marqueurs fluorescents plus petits que la GFP ou la biotine, ou encore incorporer des acides aminés non naturels dotés de fonctionnalités biorthogonales.
Conjugaison enzyme-protéine
L’incorporation d’enzymes ou de sondes spécifiques constitue une autre méthode utilisée par les chercheurs pour marquer les protéines. Parmi les conjugaisons enzyme-protéine couramment utilisées, on trouve la phosphatase alcaline (AP) et la peroxydase de raifort (HRP). L’utilisation des technologies de marquage enzyme-protéine présente de nombreux avantages, car elles permettent l’amplification du signal, offrent divers types de signaux de sortie et disposent d’une multitude de substrats pour chaque enzyme. Les signaux de sortie courants comprennent la détection par fluorescence, par chimiluminescence ou par colorimétrie. La diversité de ces signaux de sortie les rend adaptées aux applications de détection par immunohistochimie (IHC) ou par immunofluorescence (IF) dans les cellules et les tissus.
Technologies émergentes de marquage des protéines
Dans le domaine de la recherche sur les maladies et de la découverte de médicaments, la technologie de dégradation ciblée des protéines fait l’objet d’études approfondies de la part des chercheurs afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et des traitements potentiels. La technologie des chimères ciblant la protéolyse (PTC) utilise des molécules bifonctionnelles conçues pour se lier, d’un côté, à une protéine pathogène cible, tandis que l’autre extrémité se lie à une ligase E3 afin d’éliminer la protéine de la cellule. La spécificité combinée de ces molécules vis-à-vis d’un large éventail de cibles pathologiques et leur capacité à les cibler en vue de leur dégradation protéique à l’aide des systèmes cellulaires internes de dégradation des protéines en font une puissante technologie de marquage protéique pour la recherche sur les maladies.
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