Espectrometría de masas de proteínas

La espectrometría de masas de proteínas se utiliza ampliamente para analizar muestras biológicas con fines de descubrimiento de biomarcadores, investigación proteómica y aplicaciones clínicas. En comparación con otras técnicas empleadas para la caracterización a gran escala de proteínas, la espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta fundamental para la proteómica gracias a su capacidad para realizar análisis complejos.

La espectrometría de masas se utiliza para identificar y caracterizar cuantitativamente las proteínas en función de su estructura, sus modificaciones postraduccionales y sus interacciones.

La identificación de proteínas suele implicar la digestión química o enzimática de las proteínas en péptidos, que posteriormente se analizan mediante espectrometría de masas y se identifican utilizando métodos computacionales o secuenciación.
Las modificaciones postraduccionales pueden identificarse a través de cambios en la masa de los residuos de aminoácidos. Los sitios de modificación pueden localizarse mediante secuenciación o métodos computacionales.
Para el análisis y la caracterización de glicanos, se utilizan métodos enzimáticos o químicos para liberar los restos de glicanos de las glicoproteínas, seguido de la derivatización de los glicanos liberados para su análisis mediante espectrometría de masas.
Las interacciones proteicas se determinan mediante la copurificación por afinidad de una proteína diana específica con cualquier proteína con la que interactúe, o se estudian de forma más global mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico antes de su análisis mediante espectrometría de masas.

En proteómica cuantitativa, las proteínas o los péptidos pueden marcarse químicamente con isótopos estables mediante el método de marcado en tándem (TMT) e iTRAQ, o bien metabólicamente mediante la incorporación de aminoácidos marcados (SILAC). La comparación de la incorporación de isótopos pesados y ligeros permite la cuantificación relativa al correlacionar las intensidades de los picos de la espectrometría de masas con las abundancias de las proteínas. Para la cuantificación absoluta, las muestras pueden enriquecerse con péptidos sintéticos marcados isotópicamente o con estándares proteicos para el análisis
mediante monitorización de reacciones seleccionadas (SRM).

En la espectrometría de masas de proteínas, las masas de las diferentes proteínas y péptidos se determinan midiendo la relación m/z (masa/carga) de sus iones en fase gaseosa. Los espectrómetros de masas convierten primero las moléculas de proteína en iones en fase gaseosa mediante una fuente de iones. A continuación, un analizador de masas separa los analitos ionizados en función de la relación m/z. Posteriormente, un detector registra el número de iones para cada valor de m/z. La ionización MALDI y la ionización por electrospray (ESI) se utilizan habitualmente para ionizar péptidos o proteínas.

Espectrometría
de masas MALDI-TOF

MALDI es un método de ionización que utiliza una matriz que absorbe la energía del láser para generar iones con una fragmentación mínima de las moléculas proteicas. En primer lugar, la muestra se mezcla con un material de matriz adecuado. A continuación, un láser pulsado irradia la muestra, lo que provoca la ablación y la desorción tanto de la muestra como del material de matriz. Las moléculas del analito se ionizan entonces mediante protonación o desprotonación en los gases ablacionados antes de su análisis mediante espectrometría de masas.

Espectrometría
de masas con ionización por electrospray

La ionización por electrospray (ESI) produce iones mediante un electrospray en el que se aplica alta tensión a la muestra líquida para crear un aerosol, lo que genera iones con una fragmentación mínima de los péptidos y las proteínas. La ionización por electrospray se utiliza habitualmente al acoplar la espectrometría de masas a la cromatografía líquida (LC-MS), ya que el eluido de la cromatografía líquida puede introducirse directamente en un electrospray para su procesamiento en tándem.

Flujo de trabajo

Preparación de muestras para el análisis de proteínas mediante espectrometría de masas

Preparación de muestras de proteínas

La preparación de muestras proteicas para la espectrometría de masas requiere la lisis celular o la solubilización y estabilización de las proteínas. Para el análisis proteómico, las células se lisan utilizando tampones que rompen la membrana celular, junto con inhibidores de proteasas para evitar la degradación de las proteínas. Las proteínas de alta abundancia se eliminan según sea necesario. La recuperación y el enriquecimiento de fracciones seleccionadas facilitan el análisis proteómico.

Purificación de péptidos séricos para espectrometría de masas

Proteólisis específica de cada sitio en muestras para la espectrometría de masas de proteínas

Digestión y etiquetado

Las proteasas específicas de sitio, como la tripsina, se utilizan para escindir las proteínas en fragmentos pequeños que permitan su identificación, ya sea comparando los espectros experimentales con los espectros teóricos de las bases de datos de proteínas o comparándolos con los estándares de la analítica. Para la cuantificación relativa, los cultivos celulares pueden marcarse metabólicamente mediante la incorporación de isótopos estables a través de la alimentación con aminoácidos, o bien las muestras pueden marcarse con isótopos estables mediante métodos químicos. La adición de péptidos sintéticos marcados isotópicamente a las muestras permite la cuantificación absoluta mediante el análisis de monitorización de reacciones seleccionadas (SRM).

Uso de calibradores y patrones en la espectrometría de masas de proteínas

Calibración y estandarización en la espectrometría de masas de proteínas

Los patrones de calibración pueden servir como controles para el análisis de muestras y utilizarse para determinar la identidad de las proteínas, la sensibilidad experimental y la eficiencia de la digestión, además de facilitar la separación cromatográfica y el análisis cuantitativo.

Uso de la cromatografía en tándem en la espectrometría de masas de proteínas

Separación cromatográfica

La cromatografía permite separar las proteínas y los péptidos en muestras más manejables para su análisis. Dado que varios péptidos distintos pueden tener masas similares, se suele utilizar la HPLC para evitar que se introduzcan simultáneamente en el espectrómetro de masas péptidos con masas muy similares o idénticas, lo que aumenta el rango dinámico global de las mediciones.

Detección y análisis

Las proteínas y los péptidos se ionizan mediante MALDI o ESI antes de su detección y análisis. Un analizador de masas distingue los iones en función de sus valores m/z. Los patrones de fragmentación resultantes pueden utilizarse para la identificación, y las muestras pueden cuantificarse de forma relativa evaluando las relaciones de intensidad de los picos de muestras diferenciadas mediante marcaje isotópico, o bien cuantificarse de forma absoluta mediante el análisis SRM con patrones internos marcados.

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