克隆与表达

蛋白质表达载体

质粒，即蛋白质表达载体，是一段环状DNA，其中包含众多用于克隆和表达目标蛋白的功能元件。合适表达载体的选择在一定程度上取决于蛋白质的类型、将表达该蛋白质的宿主生物，以及研究者旨在解决的具体应用问题和科学问题。目前可用的表达载体种类繁多，这使得研究者能够根据自身研究需求，选择最适合的克隆、克隆筛选和蛋白质表达元件。 一旦选定了目标基因序列和表达载体，研究人员通常会使用核酸酶在特定位点精确切割载体，从而使目标基因序列能够按阅读框克隆，并最终在宿主生物中表达。重要的是，研究人员通常会使用经化学处理的感受态细胞和细菌转化法来宿主重组DNA质粒，因为这些质粒在-70 °C冷冻保存时非常稳定。

如何转染细胞

细胞转染是指将DNA、RNA或蛋白质导入真核细胞的过程。研究人员可利用多种物理、化学和生物技术来完成蛋白质表达工作流程中的这一环节。 物理方法（如电穿孔）或化学方法（包括磷酸钙（CaPi）、聚乙烯亚胺（PEI）和脂质体转染试剂）均被研究人员广泛采用。科学家还可以使用病毒转导系统，包括慢病毒、癌逆转录病毒和腺病毒系统。然而，出于生物安全考虑，使用病毒递送方法通常需要额外的防护措施和监测。

蛋白质表达系统

研究人员利用各种生物体来表达目标蛋白。细菌是研究人员常用的选择，因为它们能高效摄取表达载体，倍增时间短，且在最佳条件下可大量生产重组蛋白。 然而，由于细菌属于原核生物，它们无法实现某些蛋白质所需的蛋白质翻译后修饰。真核细胞（包括酵母和哺乳动物细胞系）能够促进蛋白质的翻译后修饰，因此也被研究人员广泛使用。选择最适合重组蛋白表达的细胞系以及蛋白表达策略，在很大程度上取决于具体的应用需求以及科学家旨在解决的研究问题。