Marcado y detección de ácidos nucleicos

Marcaje de ácidos nucleicos y sondas

Los ácidos nucleicos pueden marcarse a lo largo de toda la molécula o en los extremos 5’ y 3’. Las sondas de ácidos nucleicos resultan especialmente útiles para ensayos de hibridación, como la detección de ARN en un Northern blot o de ADN en un Southern blot. Se utilizan diversos métodos de marcaje para distribuir el marcador a lo largo de la sonda, entre ellos la PCR con desoxinucleótidos marcados (dNTP) o trifosfatos de nucleótidos (NTP), el cebado aleatorio y la traducción de nicks. El marcaje en los extremos resulta especialmente útil para ensayos que investigan las interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas, a fin de evitar el impedimento estérico.

Ensayos de marcaje y detección de ácidos nucleicos

Dependiendo del método de marcaje, la detección colorimétrica se utiliza a menudo para sondas marcadas con enzimas, mientras que la detección autorradiográfica es adecuada para sondas radiactivas. Entre las sondas más comunes se encuentran las marcadas con digoxigenina (DIG) y con fluoresceína, y pueden utilizarse en combinación para facilitar la detección multicolor de sondas cuando se acoplan a reacciones colorimétricas (p. ej., fosfatasa alcalina). Del mismo modo, la incorporación de biotina-16-dUTP mediante PCR también es posible con la mayoría de las polimerasas de ADN como método adicional de marcaje y detección. La hibridación in situ fluorescente (FISH) utiliza sondas fluorescentes para detectar secuencias de ADN, y el éxito de la detección y el análisis posterior depende en parte de la sensibilidad y la resolución del microscopio fluorescente del que disponga el investigador.

Aplicaciones del ADN y el ARN marcados

La transferencia de macromoléculas a membranas en fase sólida se conoce como «blotting». Debido a la especificidad de las sondas marcadas, la hibridación del ácido nucleico y la sonda ofrece a los investigadores la capacidad de detectar tanto secuencias de ADN como de ARN en mezclas complejas de ácidos nucleicos. Además, estos métodos permiten recabar información valiosa adicional, como el análisis de la expresión génica, el tamaño del ARNm y el número de copias, en función del ensayo. La hibridación in situ también es utilizada habitualmente por los investigadores para detectar una o más sondas marcadas de forma diferente (por ejemplo, sondas marcadas con DIG y con fluoresceína).