Secuenciación

Secuenciación de Sanger

En sus inicios, los métodos de química analítica permitían determinar la composición de los ácidos nucleicos. Sin embargo, Fred Sanger y sus colaboradores desarrollaron métodos —que inicialmente utilizaban fragmentos digeridos marcados radiactivamente y fraccionamiento bidimensional— para obtener algunas de las primeras secuencias nucleicas completas. Los avances en este campo continuaron durante varias décadas, y cada mejora contribuyó a ampliar la biblioteca de proteínas y genomas secuenciados. Entre estas mejoras se incluyen la separación de los nucleótidos por longitud mediante electroforesis en gel seguida de electroforesis capilar. Además, la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia y el análisis informático automatizado de cada fragmento de ácido nucleico definen en la actualidad el método moderno de secuenciación de Sanger.

Metodología de secuenciación del ADN

Aunque los métodos para secuenciar el ADN han seguido mejorando desde los orígenes de esta tecnología, varios componentes fundamentales siguen siendo necesarios y se utilizan en las plataformas modernas de secuenciación del ADN. La preparación del ADN suele incluir el aislamiento y la purificación del ADN del organismo huésped. Otros componentes esenciales, como las bases de ADN libres, los cebadores de ADN, las bases de ADN modificadas que contienen marcadores fluorescentes (bases terminadoras) y la ADN polimerasa, se añaden juntos en un único recipiente. El recipiente que contiene todos estos componentes, tras una serie de pasos de calentamiento y enfriamiento, producirá una biblioteca de secuencias de ADN pequeñas en relación con la secuencia de ADN completa de interés, cada una de las cuales termina con una base terminadora marcada con fluorescencia en el extremo. Las nuevas cadenas de ADN que contienen los nucleótidos marcados con fluorescencia en el extremo se separan por longitud, se hacen pasar a través de un tubo capilar y se ordenan por tamaño. A continuación, se utiliza un láser para excitar la base fluorescente de cada cadena, mientras que una cámara captura la señal. Por último, se suele utilizar un ordenador para ensamblar la información recopilada y obtener la secuencia de ADN completa.