Medio de expansión de células madre mesenquimatosas (1x)

Descongelación de células:

1. No descongele las células hasta tener a mano el medio recomendado y los artículos de plástico o de vidrio apropiados.
2. Retire del nitrógeno líquido el vial con las células madre mesenquimatosas e incúbelo en un baño María a 37°C. Controle muy de cerca hasta que las células estén completamente descongeladas. La viabilidad máxima de las células depende de la descongelación rápida y completa de las células congeladas. IMPORTANTE: no agite las células en Vórtex.
3. En cuanto las células estén completamente descongeladas, desinfecte el exterior del vial con etanol al 70 %. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
4. En una campana de flujo laminar, utilice una pipeta de 1 o 2 ml para transferir las células a un tubo cónico estéril de 15 ml. Tenga cuidado de no introducir burbujas durante el proceso de transferencia.
5. Con una pipeta de 10 ml, añada lentamente gota a gota 9 ml de medio de expansión de células madre mesenquimatosas (precalentado a 37°C) al tubo cónico de 15 ml. IMPORTANTE: no añada todo el volumen de medio a la vez a las células. Esto puede producir una disminución de la viabilidad celular debido a un choque osmótico.
6. Mezcle con suavidad la suspensión celular pipeteando dos veces hacia arriba y hacia abajo lentamente. Tenga cuidado de no introducir burbujas. IMPORTANTE: no agite las células en Vórtex.
7. Centrifugue el tubo a 300 x g durante 2-3 minutos para que se depositen las células.
8. Decante la mayor cantidad posible de sobrenadante. Los pasos 4 a 8 son necesarios para eliminar el crioconservante residual (DMSO).
9. Resuspenda las células en un volumen total de 10 ml de medio de expansión de células madre mesenquimatosas (precalentado a 37°C).
10. Coloque la mezcla de células en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm.
11. Incube las células a 37°C en un incubador humidificado con CO₂ al 5 %.
12. Al día siguiente, cambie el medio por medio de expansión de células madre mesenquimatosas reciente (precalentado a 37°C). Cambie por medio reciente cada dos o tres días a partir de entonces.
13. Cuando las células tengan una confluencia de aproximadamente el 80 %, pueden disociarse con Accutase^® y subcultivarse o congelarse para su uso posterior.

Subcultivo:

1. Retire cuidadosamente el medio de la placa de cultivo de tejidos de 10 cm que contiene la capa confluente de células madre mesenquimatosas.
2. Aplique 3-5 ml de Accutase e incube en una incubadora a 37°C durante 3 minutos.
3. Inspeccione la placa y asegúrese del desprendimiento completo de las células golpeando suavemente el lateral de la placa con la palma de la mano. 4. Aplique 5 ml de medio de expansión de células madre mesenquimatosas (precalentado a 37°C) a la placa.
5. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml.
6. Centrifugue el tubo a 300 x g durante 2-3 minutos para que se depositen las células.
7. Descarte el sobrenadante
8. Aplique 2 ml de medio de expansión de células madre mesenquimatosas al tubo cónico y resuspenda bien las células. IMPORTANTE: No agite en Vórtex.
9. Cuente el número de células utilizando un hemocitómetro.
10. Coloque las células a la densidad deseada en los matraces, placas o pocillos apropiados en el medio de expansión de células madre mesenquimatosas. Normalmente colocamos ~2 millones de células por placa de 10 cm o matraz T75.

El medio de expansión de células madre mesenquimatosas es una formulación patentada que contiene suero fetal bovino.

El medio de expansión de células madre mesenquimatosas debe conservarse a -20°C hasta que vaya a utilizarse Tras su descongelación, el medio basal debe conservarse a 2-8°C durante un máximo de un mes.

Se comprueba el crecimiento celular y la proliferación óptimos de las células madre mesenquimatosas en cada lote de medio. Ensayos de esterilidad: Negativo

Accutase is a registered trademark of Innovative Cell Technologies, Inc.

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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