Comptage cellulaire et analyse de l'état de santé

Comptage manuel des cellules

Les chambres de comptage cellulaire, telles que l’hémocytomètre équipé de grilles de Neubauer, sont des dispositifs couramment utilisés pour le comptage manuel/visuel des cellules. Une petite aliquote de suspension cellulaire est déposée dans la chambre d’un dispositif en verre rectifié avec précision et muni d’une grille, où elle se disperse sur la grille gravée par capillarité. Les cellules sont observées au microscope et comptées à l’aide d’un compteur manuel. Le volume prédéfini de la chambre et le système de grille permettent de calculer la concentration cellulaire. Il existe des systèmes basés sur l’imagerie qui automatisent le processus de comptage.

Comptage cellulaire automatisé

De nombreux appareils de comptage cellulaire automatisé utilisent les mêmes colorants et principes de comptage visuel que ceux employés en hémocytométrie. Contrairement aux compteurs cellulaires automatisés qui reposent sur la reconnaissance d’objets, les appareils basés sur le principe de Coulter ont gagné en popularité grâce à leur facilité d’utilisation et à leur précision. Les compteurs de Coulter font circuler des suspensions cellulaires à travers un capteur qui détecte les cellules en fonction d’une variation de la résistance électrique. Cela permet une détection plus fiable des cellules, même les plus petites, ainsi que des comptages de haute précision. Les modèles portables, tenus à la main (à l’instar d’une pipette), permettent de compter directement les cellules depuis la hotte de culture.

Dosages de viabilité cellulaire

Synthèse de l’ADN : la surveillance de la synthèse active de l’ADN dans les cellules constitue la base de certains tests de prolifération cellulaire. La réplication de l’ADN peut être mesurée en incorporant des nucléosides modifiés, tels que la 3H-thymidine radioactive ou la bromodésoxyuridine (BrdU) non radioactive, qui est détectée à l’aide d’un anticorps.

Activité métabolique : Les tests calorimétriques mesurant l’activité métabolique conviennent à l’analyse de la prolifération cellulaire, de la viabilité cellulaire et de la cytotoxicité. La réduction des sels de tétrazolium, tels que le MTT, le XTT et le WST-1, en composés formazaniques colorés ne se produit que dans les cellules métaboliquement actives. La présence d’ATP est également un indicateur de l’activité métabolique. Dans le test de reporter à la luciférase de luciole, l’ATP produit par les cellules en division est utilisé pour oxyder la D-luciférine, ce qui génère une lumière bioluminescente servant de résultat.

Exclusion de colorant : la coloration au bleu de Trypan est couramment utilisée pour le comptage des cellules viables. Cette méthode repose sur le principe selon lequel les cellules vivantes n’absorbent pas le colorant, tandis que les cellules mortes l’absorbent et apparaissent bleues au microscope.

Tests de viabilité cellulaire par fluorescence : le marquage au diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine N-succinimidyle (CFSE) est un choix courant pour mesurer le nombre de cycles de division cellulaire achevés dans une population cellulaire. Un autre colorant perméable à la membrane, la calcéine-AM, n’est pas fluorescent en soi, mais émet une forte fluorescence verte une fois hydrolysé dans une cellule viable. En revanche, le colorant nucléaire, l’iodure de propidium (PI), ne peut atteindre le noyau qu’en traversant la membrane endommagée des cellules mortes. Étant donné que la calcéine et le PI-ADN peuvent tous deux être excités par une lumière de 490 nm, il est possible de surveiller simultanément les cellules vivantes et mortes à l’aide d’un microscope à fluorescence à excitation unique.