Collagénase from Clostridium histolyticum

La collagénase issue de Clostridium histolyticum est utilisée largement dans les études biologiques, notamment pour préparer des suspensions de cellules isolées. Ce produit est adapté à la désagrégation de tissus de tumeur humaine, de rein de souris, de cerveau humain adulte et fœtal, d′épithélium de poumon et de nombreux autres tissus épithéliaux. Elle s′est aussi avérée efficace dans les études de perfusion du foie et des reins, de digestion du pancréas et d′isolement de cellules de foie non parenchymateux de rat et la préparation d′hépatocytes. La collagénase a également été utilisée dans la préparation de tissu artériel pour l′étude des produits finaux de glycosylation avancée. Cette enzyme a été testée pour sa capacité à libérer les hépatocytes à une concentration d′environ 1 mg/ml. Les concentrations recommandées pour la digestion vont de 0,1 à 5 mg/ml.

Ce produit de collagénase est un mélange d′enzymes sécrétées par C. histolyticum ; les divers produits sont différenciés selon les rapports relatifs des 10-18 composants présents dans les enzymes sécrétées. Les composants principaux sont constitués de deux collagénases, de la clostripaïne et d′une protéase neutre. L′action synergique de ces enzymes dégrade le collagène et d′autres substances intracellulaires. L′action des deux collagénases et de la protéase neutre est nécessaire pour détacher efficacement des cellules d′un tissu. Divers types de collagènes sont les substrats naturels de la collagénase.

La collagénase est activée à l′aide de quatre atome-grammes de calcium par mole d′enzyme. Elle est inhibée par l′acide éthylèneglycol-bis(bêta-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique, le bêta-mercaptoéthanol, le glutathion, l′acide thioglycolique et la 8-hydroxyquinoline.

Tel qu′il est livré, le produit est stable un an à -20 °C. Aucune perte de l′activité FALGPA ou protéase n′est observée au bout de 30 jours à 37 °C, 50 °C et -20 °C. Les solutions de collagénase brute sont stables lorsqu′elles sont congelées rapidement en aliquotes (à 10 mg/ml) et conservées à -20 °C. Tout cycle de congélation/décongélation supplémentaire détériore la solution. Le produit conserve 100 % de son activité pendant 7 heures lorsqu′il est placé sur de la glace.

La collagénase est une protéase qui clive la protéine en triple hélice appelée collagène. Il existe trois types de collagénases tissulaires, qui appartiennent à la famille des métalloprotéinases matricielles (MPM). La collagénase issue de Clostridium histolyticum est particulièrement réactive, car elle digère le collagène par ses deux extrémités à des températures aussi basses que 4-10 °C. Les mélanges bruts de collagénase contiennent deux types principaux d′enzymes, à savoir la collagénase et la clostripaïne.

Une unité de digestion de collagène (UDC) libère une quantité de peptides à partir du collagène d′un tendon d′Achille de bovin équivalant, en termes de couleur avec la méthode à la ninhydrine, à 1,0 μmole de leucine en 5 heures à pH 7,4 et à 37 °C en présence d′ions calcium. Une unité d′hydrolyse de FALGPA hydrolyse 1,0 μmole de furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala par minute à 25 °C. Une unité de protéase neutre hydrolyse la caséine et produit une couleur équivalente à 1,0 μmole de tyrosine en 5 heures à pH 7,5 et à 37 °C. Une unité de clostripaïne hydrolyse 1,0 μmole de BAEE par minute à pH 7,6 et à 25 °C en présence de DTT.

Ce produit est équivalent à la première fraction de sulfate d′ammonium (jusqu′à 40 %) selon Mandl, I., et coll., J. Clin. Invest., 32, 1323 (1953). Les solutions sont habituellement préparées à une concentration de 1-2 mg/ml dans du tampon TESCA (TES 50 mM, chlorure de calcium 0,36 mM, pH 7,4 à 37 °C).