Collagénase from Clostridium histolyticum

La collagénase issue de Clostridium histolyticum a été utilisée dans les applications suivantes :

• isolement de cellules de Sertoli.
• comparaison de méthodes enzymatiques.
• préparation de tissus pour l'immunocytochimie.
• extraction de sperme testiculaire.
• préparation de suspensions unicellulaires.
• immunofluorescence.

Ce produit convient à la désagrégation des tissus tumoraux humains, des tissus rénaux murins, des tissus cérébraux et pulmonaires adultes et fœtaux humains ainsi que de nombreux autres tissus épithéliaux. Il se révèle aussi utile pour l'étude de la perfusion hépatique et rénale, la digestion du tissu pancréatique, l'isolement des cellules hépatiques non parenchymateuses murines et la préparation des hépatocytes. La collagénase a également été utilisée dans la préparation de tissu artériel pour l'étude des produits finaux de glycosylation avancée. Cette enzyme a été testée pour sa capacité à détacher les hépatocytes à une concentration d'environ 1 mg/ml. Les concentrations utilisées pour la digestion vont de 0,1 à 5 mg/ml.

Ce produit peut être utilisé pour préparer des suspensions de cellules individuelles en vue d'un séquençage.

Ce produit de collagénase est un mélange d′enzymes sécrétées par C. histolyticum ; les divers produits sont différenciés selon les rapports relatifs des 10-18 composants présents dans les enzymes sécrétées. Les composants principaux sont constitués de deux collagénases, de la clostripaïne et d′une protéase neutre. L′action synergique de ces enzymes dégrade le collagène et d′autres substances intracellulaires. L′action des deux collagénases et de la protéase neutre est nécessaire pour détacher efficacement des cellules d′un tissu. Divers types de collagènes sont les substrats naturels de la collagénase.

La collagénase est activée à l′aide de quatre atome-grammes de calcium par mole d′enzyme. Elle est inhibée par l′acide éthylèneglycol-bis(bêta-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique, le bêta-mercaptoéthanol, le glutathion, l′acide thioglycolique et la 8-hydroxyquinoline.

Tel qu′il est livré, le produit est stable un an à -20 °C. Aucune perte de l′activité FALGPA ou protéase n′est observée au bout de 30 jours à 37 °C, 50 °C et -20 °C. Les solutions de collagénase brute sont stables lorsqu′elles sont congelées rapidement en aliquotes (à 10 mg/ml) et conservées à -20 °C. Tout cycle de congélation/décongélation supplémentaire détériore la solution. Le produit conserve 100 % de son activité pendant 7 heures lorsqu′il est placé sur de la glace.

La collagénase est une protéase qui clive la protéine en triple hélice appelée collagène. Il existe trois types de collagénases tissulaires, qui appartiennent à la famille des métalloprotéinases matricielles (MPM). La collagénase issue de Clostridium histolyticum est particulièrement réactive, car elle digère le collagène par ses deux extrémités à des températures aussi basses que 4-10 °C. Les mélanges bruts de collagénase contiennent deux types principaux d′enzymes, à savoir la collagénase et la clostripaïne.

Une unité de digestion de collagène (UDC) libère une quantité de peptides à partir du collagène d′un tendon d′Achille de bovin équivalant, en termes de couleur avec la méthode à la ninhydrine, à 1,0 μmole de leucine en 5 heures à pH 7,4 et à 37 °C en présence d′ions calcium. Une unité d′hydrolyse de FALGPA hydrolyse 1,0 μmole de furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala par minute à 25 °C. Une unité de protéase neutre hydrolyse la caséine et produit une couleur équivalente à 1,0 μmole de tyrosine en 5 heures à pH 7,5 et à 37 °C. Une unité de clostripaïne hydrolyse 1,0 μmole de BAEE par minute à pH 7,6 et à 25 °C en présence de DTT.

Cette collagénase est obtenue à partir de filtrats de culture de Clostridium histolyticum. On pense que le filtrat de culture contient au moins 7 protéases différentes, de poids moléculaires allant de 68 à 130 kDa. Ceci est un produit de type I-A. Les solutions sont habituellement préparées à une concentration de 1-2 mg/ml dans du tampon TESCA (TES 50 mM, chlorure de calcium 0,36 mM, pH 7,4 à 37 °C).