Crecimiento y mantenimiento celular
El cultivo celular es una técnica fundamental que se utiliza en la investigación en ciencias de la vida para establecer modelos biológicos relevantes o para producir proteínas recombinantes, partículas víricas o terapias biológicas. El crecimiento y el mantenimiento de las células cultivadas, como bacterias, levaduras y células de mamíferos, se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad (a menudo denominada campana de cultivo celular o tisular), utilizando técnicas de esterilidad adecuadas para evitar la contaminación microbiana y química.
Tipos de cultivo celular
Dos de los enfoques más destacados del cultivo de células de mamíferos son el cultivo primario y el cultivo continuo. Los cultivos primarios se obtienen directamente a partir de tejido humano o animal y tienen una vida útil en cultivo limitada por la senescencia celular. Los cultivos continuos se consideran «inmortales» en cultivo, ya que a menudo se obtienen a partir de tejido canceroso de pacientes. Las líneas celulares también pueden crearse mediante la inmortalización de células y pueden propagarse o pasarse en serie durante numerosos ciclos de división celular, o incluso de forma indefinida.
Categorías destacadas
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Rico en factores que favorecen el crecimiento, el suero fetal bovino (FBS) o el suero fetal de ternera (FCS) es un complemento ideal para el cultivo de células de mamíferos.
Las células pueden cultivarse en suspensión o como una monocapa 2D que se adhiere al frasco de cultivo tisular o a la placa multipocillo. El método de cultivo viene determinado por el tejido de origen de las células; las células derivadas de la sangre suelen crecer en suspensión, mientras que las derivadas de tejidos sólidos suelen crecer en monocapas.
Se considera que los modelos de cultivo celular tridimensional (organoides y esferoides) imitan más fielmente el entorno in vivo de las células que las células cultivadas en superficies bidimensionales. Los esferoides se forman a menudo a partir de líneas celulares cancerosas o biopsias tumorales (xenotransplantes derivados de pacientes, o PDX) como agregados celulares que flotan libremente en placas de adhesión ultrabaja, mientras que los organoides se obtienen habitualmente a partir de células madre tisulares incrustadas y posteriormente diferenciadas dentro de una matriz de hidrogel de la MEC.
Fases del crecimiento celular
Garantizar un crecimiento celular adecuado es fundamental para obtener datos precisos en los estudios de cultivos celulares. El recuento celular puede determinarse mediante un hemocitómetro o un contador celular automático, que ofrece recuentos más precisos.
El crecimiento celular en cultivo suele producirse en cuatro fases:
- Fase de latencia: las células se están adaptando a las condiciones del cultivo y no se dividen.
- Fase de crecimiento logarítmico: las células se dividen activamente, por lo que es la mejor etapa para evaluar el crecimiento de la población u obtener datos. La fase logarítmica tardía es el mejor momento para realizar el paso (subcultivo) de las células.
- Fase de meseta (estacionaria): el crecimiento se ralentiza a medida que las células se acercan al 100 % de confluencia, y las células son más susceptibles al estrés o a las lesiones, ya que se acumulan los residuos celulares y se agotan los recursos.
- Fase de declive: la población de células vivas disminuye a medida que predomina la muerte celular.
Medios de cultivo celular, suplementos y reactivos
Las células en cultivo requieren un aporte de nutrientes para crecer. Los medios de cultivo de células de mamíferos deben mantener un pH fisiológico, además de proporcionar una mezcla equilibrada de sales, hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y lípidos, proteínas y péptidos, oligoelementos y factores de crecimiento. El suero fetal bovino (FBS) es el suplemento de crecimiento más utilizado para el cultivo de células de mamíferos, ya que contiene muchos de estos nutrientes celulares esenciales y se ha demostrado que favorece el crecimiento de células y tejidos en cultivo. Para aplicaciones que requieren medios definidos o con un contenido reducido de componentes de origen animal, las formulaciones de medios «xeno-free» ofrecen composiciones de composición conocida y libres de componentes animales.
Dado que los medios y los suplementos suelen proporcionar nutrientes abundantes para el crecimiento de microbios oportunistas, un cultivo celular satisfactorio requiere técnicas asépticas y una observación regular para garantizar la ausencia de contaminantes que puedan provocar la muerte celular o alterar el crecimiento similar al in vivo. En el caso de los contaminantes microbianos comunes que no pueden observarse al microscopio, un cribado rutinario con reactivos de detección de micoplasmas protege los cultivos y los entornos de propagación de tejidos.
Los cultivos de levadura, como S. cerevisiae y P. pastoris (Pichia), se utilizan habitualmente en investigación para la expresión de proteínas recombinantes y estudios sobre la función génica. Los nutrientes esenciales que suelen incluirse en la formulación de un medio de cultivo de levadura son la peptona, el extracto de levadura y la dextrosa o la glucosa.
Consejos y trucos para el pasaje celular
El repique de células es un paso fundamental en el cultivo celular en general para mantener la salud celular y un crecimiento óptimo de las células. Este tutorial explica el proceso de repique de células, incluida la importancia de la confluencia y la densidad celular. El protocolo para el repique de células incluye procesos como la monitorización y el recuento de células, la tripsinización o disociación de las células y la resiembra de las células en nuevos recipientes de cultivo.
Entornos de cultivo celular y material
de cultivo
Las células cultivadas se cultivan y manipulan utilizando material de plástico estéril de un solo uso, como frascos de cultivo de tejidos y placas multipocillo, pipetas serológicas, filtros estériles para tapones de frascos y filtros estériles para jeringas. Los frascos y placas de plástico para cultivo de tejidos suelen tratarse para proporcionar una superficie hidrófila que facilite la adhesión de las células adherentes. Como alternativa a las superficies bidimensionales, las placas basadas en membranas microporosas proporcionan un entorno de crecimiento más fisiológico para ensayos celulares complejos, como la migración celular, la comunicación célula-célula y la polarización celular.
Las células cultivadas deben mantenerse a la temperatura y en el entorno gaseoso que reproduzcan estos parámetros en el organismo del que proceden. Los recipientes de cultivo que contienen células y medios se mantienen normalmente en aparatos de incubación que proporcionan un control preciso de la temperatura y las mezclas de gases. Sin embargo, los sistemas de incubación de sobremesa a pequeña escala que emplean microfluídica y facilitan la obtención de imágenes de las células en cultivo ininterrumpido pueden proporcionar los entornos más auténticos para modelos in vitro predictivos.
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