Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una potente técnica básica de biología molecular que constituye un método in vitro eficaz y rápido para la amplificación enzimática de secuencias específicas de ADN o ARN procedentes de diversas fuentes. Una PCR estándar consta de ADN diana, un conjunto de cebadores de oligonucleótidos sintéticos que flanquean la secuencia de ADN diana, una ADN polimerasa termoestable (normalmente Taq polimerasa) y nucleótidos. Utilizando termocicladores, hay tres etapas durante cada ciclo de amplificación, que incluyen la desnaturalización del ADN de doble cadena (dsADN) en ADN monocatenario separado, el recocido de los cebadores a la secuencia de ADN diana y la extensión, en la que la ADN polimerasa extiende el ADN de los cebadores, creando nuevo dsADN con una cadena antigua y otra nueva. Las hebras sintetizadas en un ciclo sirven como molde en el siguiente, lo que resulta en un aumento de un millón de veces en la cantidad de ADN en sólo 20 ciclos.
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PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)
La RT-PCR, o PCR de transcriptasa inversa, es una variación de la técnica PCR estándar que implica la amplificación de ARNm específico obtenido a partir de muestras muy pequeñas. Elimina la necesidad del tedioso proceso de purificación del ARNm que requieren las técnicas de clonación convencionales. Con la RT-PCR, se utilizan la transcriptasa inversa y una muestra de ARN, además de los reactivos estándar de la PCR. La mezcla de reacción se calienta a 37 ˚C, lo que permite la producción de una copia complementaria de ADNc a partir de la muestra de ARN por la transcriptasa inversa. A continuación, este ADNc se une a uno de los cebadores, lo que da lugar a la síntesis de la primera cadena. A partir de aquí se realiza la PCR estándar, en la que finalmente se genera dsADN. La RT-PCR se combina frecuentemente con la PCR a tiempo real (qPCR), que se utiliza ampliamente para la cuantificación de los niveles de transcripción en células y tejidos.
PCR de arranque en caliente
La PCR de arranque en caliente es una tecnología que inhibe la Taq polimerasa de arranque en caliente o la incorporación de dNTPs modificados durante la preparación de la reacción hasta que se produce un paso de activación por calor. Existen varios métodos para detener la actividad de la polimerasa de arranque en caliente, entre los que se incluyen la modificación química, los métodos mediados por anticuerpos y los métodos mediados por aptámeros.
PCR de punto final para la amplificación de dianas largas y precisas
La PCR de punto final se utiliza a menudo para detectar la presencia de dianas y su abundancia relativa al finalizar la reacción. La longitud limitada de las secuencias producidas durante la PCR estándar, aproximadamente 5 kb, se supera en parte con la incorporación de factores adicionales que proporcionan actividad de "corrección de pruebas". La PCR larga y precisa (LA) incorpora el uso de una segunda polimerasa termoestable con 3′→5′ exonucleasa para reparar las incorporaciones erróneas de nucleótidos terminales, lo que resulta en una fidelidad significativamente mayor y en la capacidad de amplificar dianas de ADN de hasta 40 kb de longitud.
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