Anticorps anti-N1-phosphohistidine (1-pHis), clone SC1-1

La phosphorylation joue un rôle important dans la régulation de l'activité des protéines et de divers événements de signalisation cellulaire. Limitée par les outils disponibles pour la détection des phosphohistidines (pHis), la majorité des études se concentre sur la phosphorylation des sérines, des thréonines et des tyrosines. La phosphorylation de l'histidine peut se produire soit en N1 (1-pHis) soit en N3 (3-pHis) du cycle imidazole. Le développement de peptides contenant des analogues phosphoryltriazolylalanine stables de 1-pHis et 3-pHis (1-pTza et 3-pTza) permet de générer des anticorps pour étudier les phosphorylations N1 et N3 de l'histidine dans les événements de signalisation. Les preuves de l'implication des His kinases dans le cancer et les métastases tumorales sont de plus en plus nombreuses et le premier gène suppresseur de métastases identifié est l'une des deux His kinases de mammifères connues, Nm23-H1 (également connue sous le nom de NME1, nucléoside diphosphate kinase A, ou NDPK-A). Le Nm23-H1/NME1 et le Nm23-H2 (NME2/NDPK-B), qui lui est étroitement lié, catalysent le transfert du phosphate de l'ATP vers les nucléosides-diphosphates (NDP) par le biais d'un intermédiaire enzymatique 1-pHis. Les Nm23-H1/-H2 possèdent également une activité His kinase, qui transfère le phosphate du site actif pHis sur un His d'une protéine cible. Les enzymes métaboliques telles que la phosphoglycérate mutase (PGAM), la Succinyl-CoA synthétase (SCS) et l'ATP citrate lyase (ACL) utilisent également le pHis comme intermédiaire enzymatique. Contrairement à la NME1/2, la PGAM utilise le 3-pHis comme intermédiaire enzymatique. Outre les eucaryotes, la phosphorylation de l'histidine est bien documentée dans les voies de signalisation bactériennes 'à deux composants' impliquées dans la chimiotaxie, bien que le phosphate soit transféré du pHis formé dans la protéine récepteur/capteur aux résidus Asp d'une protéine régulatrice de la réponse de l'accepteur, et que la protéine récepteur/capteur fonctionne essentiellement comme une aspartate kinase.

Variable en fonction des protéines phosphorylées sur l'histidine.

Bibliothèque de peptides aléatoires conjugués à l'hémocyanine de patelle (KLH) contenant l'analogue non hydrolysable de la phosphohistidine 1-pTza.

Épitope : N1-phosphohistidine (1-pHis)

Analyse par dot blot : Un lot représentatif a permis de détecter l'autophosphorylation in vitro du NM23-H1/NME1 humain recombinant sur His118, ainsi que des peptides contenant un analogue de phosphohistidine 1-pTza, mais pas 3-pTza. Le clone SC1-1 est le plus réactif vis-à-vis des peptides 1-pTza basés sur la séquence NM23-H1/NME1 1-pHis118, moins réactif vis-à-vis de ceux basés sur la séquence histone H4 1-pHis18 ou ACLY 1-pHis760 et le moins réactif vis-à-vis de la séquence GNB1 basée sur 1-pHis266 ou Kca3.1 basée sur le 1-pHis358 et non réactif vis-à-vis de la tyrosine phosphorylée (Fuhs, S.R., et al. (2015)). Cell. 162(1):198-210).
Analyse par western blotting : Un lot représentatif a permis de détecter la phosphorylation de l'histidine N1 sensible à la chaleur (1-pHis) dans plusieurs lysats cellulaires (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Analyse par immunocytochimie : Un lot représentatif a permis de détecter une immunoréactivité N1-phosphohistidine (1-pHis) distincte de celle de 3-pHis dans des cellules HeLa fixées au paraformaldéhyde à 4 % et dans des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine par immunocytochimie fluorescente. L'immunoréactivité 1-pHis a été trouvée dans les régions entourant les compartiments acides, mais pas à l'intérieur de ces compartiments ou des noyaux (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Purification par immunoaffinité : Un lot représentatif a été réticulé sur des résines de protéine A pour la purification par immunoaffinité des protéines 1-pHis à partir de lysats cellulaires avant l'analyse LC-MS/MS (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Remarque : NE PAS CHAUFFER LES ÉCHANTILLONS avant la détection de la phosphohistidine. La phosphorylation de l'histidine est labile à la chaleur et en milieu acide. Pour générer un contrôle négatif pour le test de spécificité, une aliquote de l'échantillon peut être chauffée à 95 ºC pendant 10 à 15 minutes afin d'inverser la phosphorylation de l'histidine. Une aliquote de l'échantillon peut également être incubée sous un pH acidifié à 37 ºC pendant 15 minutes pour réduire la phosphorylation de l'histidine. Acidifier chaque échantillon de 100 µl avec 25 µl de HCl 1 M avant l'incubation, puis neutraliser avec 25 µl de NaOH 1 M avant la détection de la phosphohistidine.

L'anticorps anti-N1-phosphohistidine (1-pHis), clone SC1-1, est un anticorps monoclonal isomère-spécifique qui détecte spécifiquement l'histidine phosphorylée en position N1. Cet anticorps monoclonal purifié est étayé par des données publiées démontrant sa performance en western blotting, en immunofluorescence et en purification par immunoaffinité.

Détecte sélectivement les protéines dont les histidines sont phosphorylées en N1 du cycle imidazole (1-pHis), mais pas les 3-pHis.

La modification ciblée ne présente pas de spécificité vis-à-vis de l'espèce.

Format : purifié

Produit évalué par le western blotting de la réaction d'autophosphorylation de NME1.

Analyse par western blotting : Une concentration de 0,3 µg/ml de cet anticorps a permis de détecter la protéine NME1 humaine recombinante (NM23-H1) avec la N1-phosphohistidine (1-pHis) dans une aliquote de 5 µg de réaction d'autophosphorylation.

Concentration : Voir la fiche technique du lot concerné.