Anticorps anti-N3-phosphohistidine (3-pHis), clone SC56-2

La phosphorylation joue un rôle important dans la régulation de l'activité des protéines et de divers événements de signalisation cellulaire. Limitée par les outils disponibles pour la détection des phosphohistidines (pHis), la majorité des études se concentre sur la phosphorylation des sérines, des thréonines et des tyrosines. La phosphorylation de l'histidine peut se produire soit en N1 (1-pHis) soit en N3 (3-pHis) du cycle imidazole. Le développement de peptides contenant des analogues phosphoryltriazolylalanine stables de 1-pHis et 3-pHis (1-pTza et 3-pTza) permet de générer des anticorps pour étudier les phosphorylations N1 et N3 de l'histidine dans les événements de signalisation. Les preuves de l'implication des His kinases dans le cancer et les métastases tumorales sont de plus en plus nombreuses et le premier gène suppresseur de métastases identifié est l'une des deux His kinases de mammifères connues, Nm23-H1 (également connue sous le nom de NME1, nucléoside diphosphate kinase A, ou NDPK-A). Le Nm23-H1/NME1 et le Nm23-H2 (NME2/NDPK-B), qui lui est étroitement lié, catalysent le transfert du phosphate de l'ATP vers les nucléosides-diphosphates (NDP) par le biais d'un intermédiaire enzymatique 1-pHis. Les Nm23-H1/-H2 possèdent également une activité His kinase, qui transfère le phosphate du site actif pHis sur un His d'une protéine cible. Les enzymes métaboliques telles que la phosphoglycérate mutase (PGAM), la Succinyl-CoA synthétase (SCS) et l'ATP citrate lyase (ACL) utilisent également le pHis comme intermédiaire enzymatique. Contrairement à la NME1/2, la PGAM utilise le 3-pHis comme intermédiaire enzymatique. Outre les eucaryotes, la phosphorylation de l'histidine est bien documentée dans les voies de signalisation bactériennes 'à deux composants' impliquées dans la chimiotaxie, bien que le phosphate soit transféré du pHis formé dans la protéine récepteur/capteur aux résidus Asp d'une protéine régulatrice de la réponse de l'accepteur, et que la protéine récepteur/capteur fonctionne essentiellement comme une aspartate kinase.

Variable en fonction des protéines phosphorylées sur l'histidine.

Analyse par dot blot : Un lot représentatif a détecté les peptides contenant un analogue de la phosphohistidine 3-pTza, mais pas les peptides contenant uniquement de la tyrosine phosphorylée. Le clone SC56-2 est le plus réactif vis-à-vis des peptides 3-pTza basés sur les séquences NM23-H1/NME1 3-pHis118 et PGAM 3-pHis11, moins réactif vis-à-vis de ceux basés sur les séquences ACLY 3-pHis760, histone H4 3-pHis18 ou Kca3.1 3-pHis358, et le moins réactif vis-à-vis de ceux basés sur la séquence GNB1 3-pHis266 (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).

Analyse par western blotting : Le surnageant de culture d'hybridomes du clone SC56-2 a été utilisé pour l'analyse par western blotting de la N3-phosphorylation sensible à la chaleur de l'histidine (3-pHis) de la protéine de fusion PGAM humaine - GST exprimée de manière exogène dans des lysats d'E. coli transformés (Fuhs, S.R., et al. (2015). Cell. 162(1):198-210).
Remarque : NE PAS CHAUFFER LES ÉCHANTILLONS avant la détection de la phosphohistidine. La phosphorylation de l'histidine est labile à la chaleur et en milieu acide. Pour générer un contrôle négatif pour le test de spécificité, une aliquote de l'échantillon peut être chauffée à 95 ºC pendant 10 à 15 minutes afin d'inverser la phosphorylation de l'histidine. Une aliquote de l'échantillon peut également être incubée sous un pH acidifié à 37 ºC pendant 15 minutes pour réduire la phosphorylation de l'histidine. Acidifier chaque échantillon de 100 µl avec 25 µl de HCl 1 M avant l'incubation, puis neutraliser avec 25 µl de NaOH 1 M avant la détection de la phosphohistidine.

L'anticorps anti-N3-phosphohistidine (3-pHis), clone SC56-2, est un anticorps monoclonal isomère-spécifique qui détecte spécifiquement l'histidine phosphorylée en position N3. Cet anticorps monoclonal (mAb) purifié est étayé par des données publiées démontrant sa performance en western blotting et en ''dot blot''.

Détecte sélectivement les protéines dont les histidines sont phosphorylées en N3 du cycle imidazole (3-pHis), mais pas les 1-pHis.

La modification ciblée ne présente pas de spécificité vis-à-vis de l'espèce.

Format : purifié

Produit évalué par le western blotting de la réaction de dégradation du 2,3-DPG catalysée par la PGAM.

Analyse par western blotting : Une concentration de 0,52 µg/mL de cet anticorps a permis de détecter la phosphoglycérate mutase (PGAM) humaine recombinante avec la N3-phosphohistidine (3-pHis) dans une aliquote de 5 µg de la réaction de dégradation du 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) catalysée par la PGAM.

Concentration : voir la fiche technique du lot concerné.