Eau destinée à la culture de cellules mammifères

La culture de cellules mammifères est essentielle à la recherche moderne en sciences de la vie et à la biofabrication. Ces cellules jouent un rôle central dans la recherche biologique, la découverte de médicaments, le développement de vaccins et la production de produits biopharmaceutiques. En reproduisant les conditions physiologiques in vitro, les cellules mammifères permettent aux scientifiques d’étudier le comportement cellulaire, d’évaluer de nouveaux traitements et de produire des produits biologiques de manière sûre et efficace. Pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, il est nécessaire de disposer de conditions de culture optimales, notamment une technique aseptique et l’utilisation d’une eau purifiée de haute qualité.

Types de cultures cellulaires : cellules primaires et lignées cellulaires immortalisées 

La culture cellulaire est une technique de laboratoire couramment utilisée qui consiste à cultiver des cellules procaryotes ou eucaryotes dans des conditions contrôlées. Les cellules sont généralement isolées à partir de tissus (cellules primaires) ou d’une lignée cellulaire immortalisée établie (cellules secondaires). Les cellules primaires n’ont qu’une durée de vie limitée, sauf si elles proviennent d’un tissu tumoral, tandis que les lignées cellulaires immortalisées peuvent se multiplier indéfiniment. Il est également possible de fusionner des cellules primaires avec une lignée cellulaire immortalisée pour produire des hybridomes, une technique utilisée pour produire des anticorps monoclonaux. La simulation des environnements complexes des cellules et tissus primaires et secondaires nécessite des milieux de culture spécialisés.

Applications de la culture cellulaire

La culture de cellules mammifères à grande échelle est largement utilisée en biotechnologie pour produire des vaccins, des protéines, des enzymes, des anticorps et des hormones. La culture cellulaire est également utilisée dans de nombreux domaines de recherche, notamment le développement pharmaceutique, où les cellules servent de modèles pour étudier des maladies telles que le cancer ou les maladies cardiaques. Les cellules cultivées sont utilisées dans l’analyse génomique, l’identification et la validation de cibles, les tests cellulaires pour le criblage à haut débit (HTS), les tests de perméabilité, ainsi que pour produire des protéines thérapeutiques. Les systèmes modernes de culture cellulaire comprennent l’analyse de cellules vivantes, la culture cellulaire en 3D et les cultures tissulaires complexes destinées à modéliser les fonctions des organes. Ces systèmes de culture cellulaire peuvent recourir à la microfluidique pour cultiver des cellules individuelles¹, ou à des bioréacteurs de grand volume pour cultiver des millions de cellules en vue d’applications diverses telles que la production de protéines recombinantes, les thérapies à base de cellules souches et même la « viande de laboratoire » cultivée en laboratoire².

Composants des milieux de culture cellulaire

Les cellules en culture sont cultivées dans des milieux de croissance spécifiques, soit en suspension, soit en cultures adhérentes (monocouche). Les milieux de culture cellulaire contiennent généralement des acides aminés, du glucose, des vitamines, des sels inorganiques et des lipides ; ils peuvent également contenir du sérum animal, des facteurs de croissance, des hormones, des antibiotiques, des antioxydants et d’autres composants. Les types de milieux comprennent les milieux à base de sérum, sans sérum, sans composants d’origine animale, sans protéines et chimiquement définis. Pour que les cellules restent en bonne santé et continuent de se développer, elles doivent disposer de nutriments en quantité suffisante ; les milieux doivent donc être renouvelés régulièrement. De plus, lorsque les lignées cellulaires adhérentes atteignent la confluence (c’est-à-dire qu’elles recouvrent toute la surface disponible), elles doivent être repiquées pour poursuivre leur croissance. Toute préparation ou tout remplacement de milieu de culture présente un risque de contamination susceptible d’affecter les résultats expérimentaux ou de détruire les stocks cellulaires. 

Impact de la qualité de l'eau sur la culture cellulaire 

Il convient de prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter tout risque de contamination cellulaire. Une contamination peut altérer la croissance et les caractéristiques des cellules, et l'utilisation, à son insu, de cellules contaminées peut conduire à des résultats inexacts ou erronés.

L'eau est utilisée à de nombreuses étapes du processus de culture tissulaire ou cellulaire. Elle constitue le principal composant des tampons et des milieux de culture, sert à dissoudre les additifs et les médicaments, et est utilisée pour le rinçage des bioréacteurs, du matériel en plastique et de la verrerie. De plus, l'eau est utilisée dans de nombreux instruments liés aux travaux de culture cellulaire, tels que les autoclaves et les incubateurs. Ainsi, la qualité de l'eau peut jouer un rôle important dans les résultats des expériences de culture cellulaire.

La contamination peut être d’origine biologique (bactéries, moisissures, levures, mycoplasmes, virus, protozoaires, etc.) ou chimique (due à la contamination des nutriments, de l’eau ou des additifs utilisés pour préparer les milieux de culture, ou encore du matériel en plastique utilisé).

La contamination des cultures cellulaires par des bactéries, des levures ou des moisissures est toujours une source de préoccupation et les scientifiques déploient des efforts considérables pour l’éviter. Ces contaminations sont généralement visibles à l’œil nu ou au microscope optique. La contamination par des substances chimiques peut également affecter la croissance, la morphologie ou le comportement des cellules cultivées, tout en restant indétectable à l’œil nu.

Impact des contaminants de l’eau sur la culture cellulaire et tissulaire

Parmi les composés naturellement présents dans l’eau susceptibles d’affecter la culture de cellules mammifères, on peut citer :

Bactéries

La contamination bactérienne peut entraîner des variations soudaines du pH des milieux de culture et contaminer des cultures pures. Les bactéries peuvent produire des toxines qui altèrent la croissance et le fonctionnement cellulaires, l’efficacité du clonage et la production de protéines recombinantes.

Endotoxines

Les endotoxines sont des lipopolysaccharides (LPS) provenant des parois des bactéries Gram-négatives. Elles constituent le type le plus courant de pyrogènes. Les macrophages et les phagocytes mononucléaires libèrent diverses cytokines pro-inflammatoires en réponse à une stimulation par les endotoxines. Les LPS sont connus pour générer des effets toxiques précoces, tels que des radicaux libres hautement destructeurs, ainsi que des actions toxiques à action lente, telles que le dysfonctionnement cellulaire, l’apoptose et la nécrose. Une eau exempte d’endotoxines est nécessaire pour les cultures de cellules mammifères.

Ions inorganiques

Il a été démontré que les métaux lourds tels que le mercure, le plomb, le zinc, le nickel, le chrome et le cadmium sont toxiques pour diverses cellules, notamment les cellules gliales et neuronales.

Composés organiques

De petites molécules organiques sont couramment présentes dans l’eau naturelle (acides humiques, tanins, pesticides, perturbateurs endocriniens, etc.) et peuvent subsister dans l’eau du robinet. Ces substances sont connues pour affecter le développement cellulaire et doivent donc être éliminées par des procédés adaptés lors de la production d’eau de qualité laboratoire.

Étude : Impact de l'eau ultra-pure ultrafiltrée sur la culture tissulaire

Des cardiomyocytes ont été isolés à partir de tissu cardiaque de rat adulte. Ils ont été lavés dans un tampon à base d’HEPES, puis mis en suspension dans un milieu minimal essentiel (MEM) et ensemencés sur des plaques recouvertes de laminine. De l’eau ultrapure a été utilisée pour préparer les tampons destinés à la procédure d’extraction et à la culture.

Deux types d’eau ont été utilisés : de l’eau ultra-pure fraîchement purifiée et ultrafiltrée (Eau A), et de l’eau ultra-pure stockée avant utilisation et non traitée par ultrafiltration (Eau B). L’effet de la qualité de l’eau sur la viabilité des cardiomyocytes a été étudié. 

Lorsque les tampons ont été préparés avec de l’eau ultra-pure fraîchement purifiée et ultrafiltrée (Eau A), de nombreux cardiomyocytes viables ont été obtenus, comme le montre leur forme allongée et striée (Figure 1A). En revanche, lorsque l’eau ultra-pure a été conservée avant utilisation et n’a pas été traitée par ultrafiltration (Eau B), peu de cellules viables ont été obtenues (Figure 1B). 

Lors du stockage d’eau ultra-pure dans une bonbonne en plastique, des bactéries sont susceptibles de se développer et de libérer des endotoxines. Dans cette étude, la concentration bactérienne dans l’eau B était d’environ 4 000 UFC/mL et la concentration en endotoxines de 8 UE/mL. Les niveaux d’endotoxines présents dans l’eau B étaient suffisamment élevés pour avoir un effet délétère sur les cardiomyocytes au cours du processus d’isolement.

En conclusion, l’utilisation d’eau ultra-pure est recommandée pour la culture cellulaire et tissulaire. L’utilisation d’eau ultra-pure fraîchement purifiée et la mise en place d’une cartouche d’ultrafiltration (polisseur Biopak®) au point d’utilisation du système de purification de l’eau éliminent le risque de contamination par les endotoxines, qui peut avoir un impact important sur les résultats des cultures cellulaires et tissulaires.

L'ultrafiltration pour l'élimination des endotoxines de l'eau

Les endotoxines (ou LPS) sont des molécules toxiques libérées par les bactéries. Elles peuvent affecter la croissance, le fonctionnement et l'efficacité de clonage de nombreux types de cellules, ce qui constitue donc un sujet de préoccupation pour les chercheurs travaillant avec des cellules.

Comme le LPS est constitué d’un groupe lipidique très hydrophobe (lipide A) lié de manière covalente à une longue chaîne complexe de polysaccharides, il a tendance à former de gros agrégats en solution aqueuse. L’ultrafiltration est une technologie membranaire qui élimine les endotoxines par un processus de filtration.    

Les données présentées à la figure 2 démontrent l’efficacité de l’élimination des endotoxines par un ultrafiltre. Le polisseur Biopak® est un dispositif d’ultrafiltration qui élimine de manière fiable même des charges importantes d’endotoxines. L’ultrafiltre est placé à la sortie du système de purification de l’eau. L’eau fournie est exempte d’endotoxines et de bactéries et ne nécessite pas de stérilisation en autoclave. 

Eau exempte d'endotoxines pour la culture cellulaire

En conclusion, l’eau ultra-pure (type 1) (présentant une résistivité de 18,2 MΩ•cm et une faible teneur en COT), purifiée à l’aide d’une cartouche d’ultrafiltration, telle que le polisseur Biopak®, convient à la préparation des milieux de culture cellulaire. Elle est exempte de bactéries et d’endotoxines, ainsi que de toute contamination chimique. L’ultrafiltration est un moyen simple et efficace d’obtenir à la demande de l’eau exempte de bactéries et d’endotoxines. Aucun stérilisation à l’autoclave de l’eau n’est nécessaire. L’eau ultra-pure purifiée par ultrafiltration peut être utilisée en toute sécurité pour la culture cellulaire, y compris la culture de cellules souches. 

Une gamme de solutions de purification de l’eau adaptées aux besoins des chercheurs travaillant avec tous les types de cultures cellulaires est disponible.

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