Eau ultra-pure pour l'analyse par LC-MS
La chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS, ou plus communément LC-MS) est une technique d'analyse puissante et polyvalente qui combine les capacités de séparation physique de la chromatographie liquide avec celles d'analyse massique de la spectrométrie de masse. Utilisée dans de nombreuses applications, la LC-MS nécessite une eau exempte de contaminants pour garantir la précision des analyses.
Présentation de la section
Applications de la LC-MS
La LC-MS offre une sensibilité et une spécificité très élevées et est utilisée pour identifier, quantifier et caractériser des composés présents dans des mélanges complexes.
Une grande variété de types d’échantillons se prête à l’analyse par LC-MS, tels que les mélanges chimiques ou pharmaceutiques, ainsi que les échantillons environnementaux, alimentaires et biologiques. La polyvalence de la LC-MS en fait un outil indispensable dans de nombreux domaines, allant de l’analyse de cellules individuelles au développement de médicaments en passant par la sécurité alimentaire. Cependant, en raison de sa sensibilité, ces applications nécessitent de l’eau ultra-pure, car même des traces de contaminants pourraient fausser les résultats.
La LC-MS occupe désormais une place centrale dans de nombreux domaines de recherche de pointe, tels que les « omiques » (protéomique, métabolomique, lipidomique), la médecine de précision et l’exposomique environnementale, permettant ainsi d’acquérir une compréhension approfondie de systèmes biologiques et chimiques complexes. Parmi les avancées de la LC-MS, on peut citer les applications à haut débit et la miniaturisation croissante.
Principe de la LC-MS
En LC-MS, les composés présents dans un échantillon sont d’abord séparés sur une colonne par chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés chimiques (voir l’article « L’eau pour l’analyse HPLC et UHPLC »). Les composés séparés sont ensuite introduits dans le spectromètre de masse (voir figure 1), où ils sont ionisés et analysés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z), ce qui permet leur identification et leur quantification. La LC-MS peut également être configurée en LC-MS/MS (spectrométrie de masse en tandem) pour une sensibilité et une spécificité accrues.
Figure 1.Représentation schématique d'un instrument LC-MS
Options d'ionisation pour la spectrométrie de masse
Dans la partie spectromètre de masse (MS) d’un instrument LC-MS, le processus commence au niveau de la source d’ions, où les composés séparés par chromatographie liquide sont ionisés. Les techniques d’ionisation courantes comprennent l’ionisation par électrospray (ESI) et l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), qui génèrent des ions chargés à partir de l’échantillon liquide :
- Ionisation par électrospray (ESI) – Les ions sont générés à pression atmosphérique en faisant passer la solution d’analyte à travers un capillaire (aiguille d’électrospray) sous haute tension (généralement de 2,5 à 4 kV). Cela crée des gouttelettes d’aérosol chargées contenant des molécules de solvant et d’analyte, qui finissent par perdre leur solvant et sont acheminées vers l’analyseur de masse.
- Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) – Les ions sont générés par des réactions entre ions et molécules à pression atmosphérique. La solution d’analyte est introduite via un capillaire dans un nébuliseur, désolvatée dans un tube en quartz chauffé, puis ionisée par des électrons issus d’une décharge corona. Ce processus permet une ionisation efficace des analytes.
Options d’analyseurs de masse pour la spectrométrie de masse
Les ions ainsi formés sont acheminés vers l’analyseur de masse, qui les sépare en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) à l’aide de diverses méthodes telles que le quadripôle, le temps de vol (TOF) ou le piège à ions :
- Quadripôle : cet analyseur utilise quatre tiges pour créer un champ électrique oscillant qui filtre les ions en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Les spectromètres de masse à quadripôle sont largement utilisés pour les analyses ciblées et quantitatives en raison de leur stabilité et de leur rapidité.
- Temps de vol (TOF) : dans un analyseur TOF, les ions sont accélérés dans un tube de vol, où ils parcourent une distance fixe. Le temps mis pour atteindre le détecteur est en corrélation avec leur m/z, ce qui permet une analyse à haute résolution sur une large gamme de masses.
- Piège à ions : cet analyseur piège les ions dans un champ électrique tridimensionnel et les éjecte séquentiellement en fonction de leur m/z. Les pièges à ions sont polyvalents et peuvent effectuer plusieurs étapes de spectrométrie de masse [(MS/MS à MS multi-étapes (MSn)] pour une analyse structurelle détaillée.
Enfin, le détecteur mesure l’abondance de chaque ion, générant ainsi un spectre de masse qui fournit des informations permettant d’identifier et de quantifier les composés présents dans l’échantillon.
Impact de la qualité de l'eau sur la LC-MS
L'eau est utilisée tout au long du processus LC-MS. Elle sert généralement à préparer la phase mobile, à diluer les étalons et à constituer les blancs. Elle est également souvent utilisée pour la préparation des échantillons. L'eau qui entre dans le circuit doit être d'une grande pureté, à la fois pour garantir la précision analytique et pour protéger l'instrument.
La LC-MS étant une technique d'analyse très sensible, elle est extrêmement sensible aux contaminants.1 De nombreux contaminants présents dans l'eau peuvent avoir un impact sur la partie HPLC du système LC-MS, tandis que d'autres affectent plus spécifiquement la détection par spectrométrie de masse (MS).
La contamination de l’eau utilisée pour la LC-MS peut affecter les résultats analytiques et les instruments de différentes manières :
Composés organiques
Les molécules organiques présentes dans l’eau utilisée pour préparer l’éluant peuvent générer un bruit de fond. Elles peuvent également interférer avec la détection par spectrométrie de masse en provoquant une suppression ou une amplification des ions. Cela peut compliquer l’identification et la quantification.
Elles peuvent s’accumuler à la surface des billes de la colonne, ralentissant ainsi l’accès des molécules d’échantillon et de solvant aux sites de liaison. Cela entraîne des problèmes de transfert de masse et se traduit par une perte de résolution et de sensibilité, ainsi que, à terme, par une durée de vie réduite de la colonne.
Les composés organiques peuvent s’accumuler à l’entrée de la colonne puis s’éluer sous forme de pics parasites ou fantômes, provoquant des interférences et compliquant la quantification.
Si le niveau de contamination organique est très élevé, le ou les contaminants peuvent entraîner un décalage du temps de rétention et une déformation de la forme des pics. Cela peut se traduire par une mauvaise résolution, ainsi que par des difficultés d’identification et de quantification.
Pour toutes ces raisons, il est essentiel de surveiller avec précision le niveau de composés organiques dans l’eau utilisée pour les analyses LC-MS, ce qui peut être réalisé de manière pratique à l’aide d’un analyseur de COT en ligne.
Ions
La contamination de l’eau par des ions métalliques (par exemple, Na+, K+) entraîne la formation d’adduits avec les molécules d’intérêt, ce qui peut compliquer la détection automatisée des pics ou la mise en correspondance avec une bibliothèque, et rendre l’interprétation des données difficile. Les halogènes, tels que le chlorure ou le bromure, peuvent provoquer une suppression d’ions en mode d’ionisation par électrospray positif (ESI+) ou augmenter le bruit de fond en mode d’ionisation par électrospray négatif (ESI-) en formant des adduits ou des complexes avec les analytes.
La présence d’ions dans l’eau peut affecter les performances globales des analyses LC-MS, ce qui a un impact sur les limites de détection et la quantification des analytes.
Particules
Les particules peuvent endommager les pompes et les injecteurs HPLC. Elles peuvent également s’accumuler dans la colonne et les frittes, entraînant une augmentation de la contre-pression.
Bactéries
Les bactéries peuvent s’accumuler dans les colonnes et les frittes. Elles peuvent également libérer des sous-produits organiques.
Étude de cas : impact de la contamination organique sur la sensibilité de la LC-MS
Pour obtenir des données LC-MS fiables, il est important de s’assurer que les analytes détectés proviennent bien des échantillons, et non de l’eau utilisée dans le processus d’analyse.
Dans cette étude, deux types d’eau ont été évalués :
- L'eau du robinet provenant du laboratoire de l'un de nos clients.
- De l’eau ultra-pure fraîchement distribuée par un système de purification d’eau Milli-Q® installé dans ce laboratoire. Le système Milli-Q® intégrait un prétraitement utilisant l’osmose inverse intelligente, l’électrodéionisation Elix® et une lampe UV bactéricide, à l’instar du système d’eau pure Milli-Q® IX. Après ce prétraitement, un système de polissage Milli-Q®, similaire au système Milli-Q® IQ 7000, a été utilisé pour fournir de l’eau ultra-pure.
L’eau du robinet du laboratoire s’est avérée contenir des traces d’estradiol, l’analyte d’intérêt, ce qui la rendait impropre à l’analyse de l’estradiol dans les échantillons à tester. En comparaison, après purification à l’aide du système de purification d’eau Milli-Q®, l’eau ultra-pure obtenue ne présentait aucune trace détectable d’estradiol et était donc adaptée à ces analyses sensibles (figure 2).
Ces résultats soulignent que, même lorsque l’eau du robinet contient des traces de contamination par l’analyte, la purification à l’aide d’un système d’eau ultrapure Milli-Q® permet d’obtenir de manière fiable une eau d’une qualité suffisante, même pour les applications analytiques les plus exigeantes. Le taux de carbone oxydable total (COT) fournit une indication générale de la contamination organique. Un taux de COT inférieur à 5 ppb est recommandé pour la LC-MS, ce qui est atteint par les systèmes d’eau ultrapure Milli-Q®.
Figure 2.Chromatogramme MRM (ESI+) de l'estradiol dans l'eau du robinet et dans de l'eau ultrapure Milli-Q® fraîchement prélevée. L’ion précurseur 273 m/z et l’ion fragment 255 m/z ont été utilisés pour la surveillance de réactions multiples (MRM) en mode ESI+ de l’estradiol. Les analyses LC-MS ont été réalisées sur un système HPLC Agilent® 1290 Infinity couplé à un système triple quadripôle Agilent® 6420 (ESI+, MRM). Une colonne Purospher® STAR RP-18 à extrémités coiffées (2 µm) Hibar® HR 50-2.1 a été utilisée pour séparer les hormones dans des conditions d’élution en gradient.
Le stockage à long terme de l'eau purifiée entraîne l'introduction de contaminants dans les analyses par LC-MS
Une fois que l’eau ultra-pure est distribuée par un système de purification, elle peut rapidement être contaminée par l’environnement du laboratoire et par les récipients utilisés pour la stocker. C’est pourquoi il est préférable d’utiliser, dans la mesure du possible, de l’eau ultra-pure fraîchement purifiée à la demande.
Les récipients en plastique libèrent généralement des composés organiques (par exemple des plastifiants) et certains ions, tandis que les flacons en verre libèrent moins de composés organiques mais peuvent tout de même libérer des ions. De plus, le stockage de l’eau ultra-pure peut favoriser la prolifération bactérienne au fil du temps, ce qui peut entraîner la libération de contaminants organiques. La figure 3 illustre comment le stockage après ouverture affecte négativement la pureté de l’eau de qualité LC-MS.
Pour minimiser ces effets, l’eau destinée à l’analyse par LC-MS doit être conservée dans des bouteilles en verre (de préférence en borosilicate) pendant une durée aussi courte que possible.
Figure 3.Comparaison des spectres de masse (A) d’eau ultra-pure Milli-Q® fraîchement produite, dont la teneur en carbone organique total (COT) est inférieure à 5 ppb et la résistivité de 18,2 MΩ·cm, produite à partir d’un système de purification d’eau ultra-pure Milli-Q® équipé d’un filtre final de 0,22 μm (Millipak®), et (B) de l’eau provenant d’une bouteille ouverte d’eau de qualité LC-MS du concurrent B après quatre semaines de stockage. Les analyses ont été réalisées par injection directe des solvants dans le spectromètre de masse fonctionnant en mode ESI positif. Source : « Four Ways to Better Water Quality in LC-MS.3 »
Spécifications relatives à l'eau de qualité LC-MS
Une gamme de solutions de purification de l'eau adaptées aux besoins des scientifiques travaillant en chromatographie liquide-spectrométrie de masse est disponible.
Une eau ultra-pure (Type 1) fraîchement purifiée, présentant une résistivité de 18,2 MΩ·cm et un COT inférieur à 5 ppb, est indispensable pour obtenir une sensibilité et une précision analytiques élevées, ainsi que des résultats LC-MS fiables et reproductibles. Le choix d’un système de purification de l’eau équipé d’un moniteur ou d’un indicateur de COT garantit que l’eau utilisée en LC-MS est exempte de contaminants organiques, susceptibles d’interférer avec l’analyse et d’affecter la précision des données. La valeur du COT fournit une assurance en temps réel de la pureté de l’eau, permettant ainsi de prendre des mesures correctives avant que les analyses ne soient compromises.
Afin de fournir une eau adaptée à l’analyse par LC-MS de composés organiques à l’état de traces et d’ultra-traces, nous avons développé le filtre LC-Pak®. Ce filtre contient de la silice à phase inversée C18 sous forme granulaire et peut être installé au point de distribution des systèmes d’eau ultra-pure Milli-Q® de type 1. Il offre un accès efficace et pratique à de l’eau ultra-pure fraîchement purifiée pour la LC-MS et la LC-MS/MS.