細胞の増殖と維持

細胞の増殖段階

細胞培養研究から正確なデータを収集するには、適切な細胞増殖を確保することが不可欠です。細胞数は、血球計数板や、より正確な細胞計数が可能な自動細胞計数装置を用いて測定できます。

培養における細胞の増殖は、一般的に以下の4つの段階を経て進行します。

1. ラグ期 – 細胞は培養条件に適応しており、分裂は行われません。
2. 対数増殖期 – 細胞が活発に分裂しているため、集団の増殖を評価したりデータを収集したりするのに最適な段階です。対数増殖期の後半は、細胞の継代（サブカルチャー）を行うのに最適な時期です。
3. プラトー（定常）期 – 細胞が100％のコンフルエンスに近づくにつれて増殖が鈍化し、細胞老廃物が蓄積し、資源が枯渇するため、細胞はストレスや損傷に対して最も脆弱な状態になります。
4. 衰退期 – 細胞死が優勢となり、生存細胞数が減少する。

細胞培養培地、添加剤および試薬

培養細胞は、増殖のために栄養素の供給を必要とします。哺乳類細胞培養培地は、バランスのとれた塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸および脂質、タンパク質およびペプチド、微量元素、ならびに成長因子を供給することに加え、生理的pHを維持しなければなりません。 胎児牛血清（FBS）は、これらの必須細胞栄養素の多くを含み、培養中の細胞や組織の増殖を促進することが実証されているため、哺乳類細胞培養において最も広く使用されている増殖用添加剤である。定義済み培地や動物由来成分を低減した培地を必要とする用途には、組成が既知の動物由来成分を含まない「ゼノフリー培地」が提供されている。

培地や添加剤は、日和見微生物の増殖に豊富な栄養源となることが多いため、細胞培養を成功させるには、無菌操作と定期的な観察を行い、細胞死を引き起こしたり、生体内と同様の増殖を妨げたりする汚染物質が存在しないことを確認する必要があります。顕微鏡では観察できない一般的な微生物汚染物質に対しては、マイコプラズマ検出試薬を用いた定期的なスクリーニングを行うことで、培養物や組織増殖環境を保護します。  

S. cerevisiae や P. pastoris（Pichia）などの酵母培養は、組換えタンパク質の発現や遺伝子機能の研究において、研究現場で広く利用されています。酵母培養培地の配合に通常含まれる重要な栄養素には、ペプトン、酵母エキス、およびデキストロースまたはグルコースがあります。

細胞の継代に関するヒントとコツ

細胞培養環境および培養用器具

培養細胞は、組織培養フラスコやマルチウェルプレート、血清用ピペット、滅菌ボトルトップフィルター、滅菌シリンジフィルターなどの、使い捨ての滅菌プラスチック製器具を用いて培養・取り扱われます。プラスチック製の組織培養フラスコやプレートは通常、付着性細胞の付着を促進するために親水性の表面となるよう処理されています。 2次元表面の代替として、微多孔性膜を用いたプレートは、細胞遊走、細胞間コミュニケーション、細胞分極といった複雑な細胞アッセイに対して、より生理的な増殖環境を提供する。

培養細胞は、その由来となる生物体におけるこれらのパラメータを再現する温度およびガス環境下で維持されなければならない。細胞と培地を含む培養器具は、通常、温度とガス混合物を精密に制御できるインキュベーター内で維持される。しかし、マイクロ流体技術を採用し、培養を中断することなく細胞のイメージングを可能にする小規模なベンチトップ型インキュベーションシステムは、予測的なin vitroモデルにとって最も忠実な環境を提供することができる。