In Situ細胞死検出キット、POD - Roche^®製品

In Situ Cell Death Detection Kit, POD

細胞レベルでのアポトーシス細胞死の検出および定量用キット。光学顕微鏡を使用した免疫組織化学および免疫細胞化学的検出に使用します。

アプリケーション

in situ 細胞死検出キット、PODは、アポトーシスを細胞レベルで光学顕微鏡検出するためにデザインされています。

利点

• 高い感度：アポトーシス細胞に対する染色効率は、ニックトランスレーション法に比べて高いとされています。
• 簡便：フルオレセイン-dUTPを使用することにより、コンバーターを使用しない場合TUNEL反応後に直接試料の解析を行なうことが可能です。
• 高い精度：分子レベル(DNA鎖の切断)でアポトーシスを検出します。また、アポトーシスにおける非常に早い段階の細胞を検出します。
• 柔軟：基質が含まれませんので、最適な染色法を選んでいただけます。

製品の記述

アポトーシスを検討する際に一般的に使用される方法には、ゲノムDNAのアガロースゲル電気泳動による解析や、³H-チミジンまたは5-Bromo-2’-deoxy-uridineを標識したDNA断片化の解析があります。これらの方法は試料細胞群において断片化していない高分子DNA群中にある、断片化低分子DNA群を分離するという意味を包括しています。したがって試料となる細胞群や組織切片中における個々の細胞の｢運命｣に関する情報を得ることはできません。アポトーシス細胞は、個々にその核クロマチンの凝縮や断片化といった形態学的な特徴によって顕微鏡観察により検出されます。しかしながらこの方法では、細胞の構造変化のピークという比較的限られた時間の枠にとらわれなければなりません。

アポトーシスの特徴は初期におけるDNAの断片化で、ヌクレオソーム間のDNAリンカー領域で切断がおこります。DNAの断片化は、二本鎖の切断および、一本鎖の切断(nicks)によって構成されています。いずれの切断タイプも、その断片のフリーの3’-OH末端を標識ヌクレオチド(ビオチン-dUTP、DIG-dUTPやフルオレセイン-dUTP)を使用した酵素反応によって標識し検出することが可能です。酵素Terminal deoxytransferase (TdT)はテンプレートに依存して、一本および二本鎖DNAの3’-OH末端における、dNTPのポリメライゼーションを触媒します。この方法はTUNEL(TdTmediateddUTP-X nick end labeling)という用語で表わされます。

TUNEL法とは別に、フリーの3’-OH末端をテンプレートに依存してDNAポリメラーゼで標識するニックトランスレーション法が知られています。TUNEL法は高感度かつ迅速な反応系であるといわれています。

測定原理

in situ 細胞死検出キット、PODはアポトーシスの初期に生じる一本鎖または二本鎖DNAの切断(断片化)を検出するためにデザインされています。アポトーシス細胞を固定、浸透させ、細胞をTUNEL反応溶液(TdTおよびフルオレセイン-dUTPを含む)でインキュベートします。このインキュベーションの間、TdTは一本鎖および二本鎖DNAのフリーの3’-OH末端にフルオレセイン-dUTPを標識する反応を触媒します。洗浄の後、DNAの切断部分に取り込まれた標識物(fluorescein)をPOD標識抗フルオレセイン抗体と反応させます。未反応の標識抗体を洗浄除去した後、免疫複合体における酵素(POD)を基質と反応させ、可視化させます。

試料

サイトスピンおよび細胞スメアや、スライドグラス上で成長した粘着細胞、凍結またはパラフィン包埋切片。

キット内容

1. 酵素溶液(TdT)、5バイアル
2. 標識溶液(フルオレセイン-dUTP)、5バイアル
3. コンバーターPOD (POD標識抗フルオレセイン) Ready-to-use

注：別売のPOD基質はDAB 基質(Cat. No. 11718096001)参照。

関連情報

• 関連製品はこちら（アポトーシス検出アッセイ一覧）
• Roche^® 製品リスト・日本語説明書・日本語SDS