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Merck

소분자 HPLC

HPLC 크로마토그램을 살펴보고 있는 과학자

소분자 분석

소분자란 분자량이 낮은(일반적으로 900 달톤 미만) 화합물을 말합니다. 소분자의 대표적인 예로는 아미노산, 지질, 당류, 지방산, 알칼로이드 등이 있습니다.  

소분자를 분리하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피(LC), 가스 크로마토그래피(GC), 얇은층 크로마토그래피(TLC), 모세관 전기영동(CE) 등 다양한 방법이 사용됩니다. 또한, 소분자의 동정 방법으로는 핵자기공명 분광법(NMR)이나 질량 분석법(MS)이 있습니다. 최근 몇 년간 액체 크로마토그래피와 질량 분석법을 결합한 LC-MS는 소분자 동정을 위한 핵심 기술로 자리 잡았습니다.

소분자의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), UHPLC 또는 LC-MS 분석에서 최상의 결과를 얻기 위해서는 가장 적합한 고정상 및 이동상 조건을 선택하는 것이 중요합니다. 분석물의 화학적 특성은 가장 적합한 컬럼 화학 구조를 선정하는 데 핵심적인 요소입니다. 또한 속도, 시료 매트릭스, 화합물 수와 같은 다른 요소들도 고정상에 가장 적합한 기질 재료를 결정하는 데 중요한 역할을 합니다.



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소분자의
HPLC

소분자의 HPLC 분석은 대부분 역상 분리 모드에서 수행됩니다. 극성 화합물의 분리에는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)와 정상상 크로마토그래피도 적합하며, 그중 HILIC이 선호되는 방법입니다. 이온성 화합물의 분리에는 이온 교환 분리 모드를, 무기 음이온이나 양이온의 분리에는 이온 크로마토그래피를 사용할 수도 있습니다.

HPLC 컬럼은 완전 다공성 실리카 입자, 표면 다공성 실리카 입자, 고분자 입자로 충전되거나, 고정상으로 모놀리식 실리카 막대로 구성된다. 또한 알루미나 산화물, 지르코니아 입자 및 탄소 입자도 사용된다. 소분자 분리를 위한 고정상 물질의 일반적인 기공 크기는 60 Å~160 Å 범위이다. HPLC의 경우 고정상의 전형적인 입자 크기는 3 µm에서 5 µm 사이이며, UHPLC의 경우 일반적으로 2 µm 이하의 더 작은 입자 크기가 사용됩니다. 고정상에 다양한 컬럼 선택성(개질)을 부여할 수 있습니다. C18 알킬 사슬은 역상(RP) 크로마토그래피에서 가장 일반적으로 사용되는 컬럼 화학 구조입니다. 그럼에도 불구하고, C30, C8, 페닐, 펜타플루오로페닐과 같은 다른 개질체와 광범위한 극성 개질체, 그리고 이온 교환 또는 키랄 특성을 가진 개질체를 통해 액체에 용해되는 거의 모든 화합물을 분리할 수 있습니다. RP-HPLC의 이동상은 일반적으로 수용성 완충액 또는 물과 아세토니트릴이나 메탄올과 같은 물과 혼합 가능한 유기 용매로 구성됩니다.

HPLC 시료 전처리

식품, 음료, 화장품, 생물학적 시료 및 매트릭스가 풍부한 의약품 제형(예: 크림, 시럽)과 같이 복잡하고 매트릭스가 풍부한 시료의 경우, 원치 않는 성분을 제거하고 관심 분석물을 선택적으로 추출하기 위해 효율적인 시료 전처리 프로토콜이 필요합니다. 이는 2 µm 이하의 입자가 사용되는 UHPLC와 같이 입자 크기가 매우 작은 고정상을 사용하는 경우 특히 중요합니다. 일반적인 시료 전처리 방법으로는 액-액 추출, 고상 추출(SPE)이 있으며, 생물학적 시료의 경우 여과 외에도 단백질 침전이 사용됩니다. 표적 화합물의 선택적 용출 및 사전 농축 외에도, 시료 전처리의 주된 목적은 시료 매트릭스로 인한 HPLC 고정상의 막힘을 방지하는 데 있습니다. 모놀리식 실리카 기반 HPLC 컬럼은 매트릭스를 상당히 잘 견딜 수 있어, 입자형 컬럼에 비해 시료 전처리 과정이 훨씬 덜 필요합니다. 

파생화

일부 분자의 경우, HPLC 분리 전(프리컬럼) 또는 후(포스트컬럼)에 유도체화가 필요합니다. 유도체화는 HPLC에서 감도를 높이거나 크로마토그래피 유지 시간을 개선하기 위해 분자를 유도체로 변환하는 과정입니다. 필요한 유도체화를 위해 바람직한 물리적 및 화학적 특성을 지닌 화학 시약이 사용됩니다.

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