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표준 PCR 프로토콜

PCR 수행하는 방법

표준 중합효소 연쇄 반응(PCR) 실험 절차는 다음 네 단계로 구성됩니다.

PCR 튜브에 필요한 시약이나 마스터믹스 및 템플릿을 넣습니다.
혼합한 후 원심분리합니다.
*가열 기능이 없는 열순환기에서 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일을 첨가합니다.
열 사이클러 및 프라이머 매개변수에 따라 증폭합니다.
아가로즈 겔 전기영동 후 에티디움 브로마이드 염색을 통해 증폭된 DNA를 확인합니다.

PCR 증폭 단계에서 PCR 튜브를 열순환기에 넣습니다.

다음에서는 이러한 단계들을 재료 및 시약 선정 요령과 함께 보다 상세히 설명합니다. 이는 Taq DNA 중합효소를 사용하는 기본적인 PCR 프로토콜입니다.

PCR 단계 및 필수 PCR 구성 요소

PCR 반응의 문제 해결에는 여러 가지 요인이 관여합니다. 이 애니메이션을 시청하여 필요에 맞는 적절한 시약과 사이클링 조건을 선택함으로써 어떻게 최적의 결과를 얻을 수 있는지 알아보세요.

다른 중합효소에 대한 추가 프로토콜이나 고급 PCR 기법에 대해서는 당사의 ‘PCR 기술 가이드’ 내 ‘프로토콜’ 섹션에서 확인하실 수 있습니다.

표준 PCR이 무엇인지 등 표준 PCR에 대한 자세한 내용은 당사의 ‘PCR 기초’ 페이지에서 확인하십시오.

시약: PCR에 필요한 것은 무엇인가요?

Taq 폴리머라제란 무엇인가?

Taq DNA 중합효소는 고온성 세균인 Thermus aquaticus에서 유래한 내열성 효소입니다. 이 효소는 일반적으로 PCR에서 DNA 단편을 증폭하는 데 사용됩니다. 이 효소는 대장균(E. coli)에서 발현된 재조합 형태입니다. 이 효소는 (PCR 기법에서 요구되는 바와 같이) 95 °C까지 반복적으로 가열해도 활성이 현저하게 저하되지 않습니다. 이 효소의 분자량은 SDS-PAGE 측정 결과 약 94 kDa이며, 검출 가능한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성은 없습니다. 5'→3' DNA 폴리머라제 활성과 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타냅니다. Taq DNA 중합효소의 각 로트는 PCR 증폭 및 이중가닥 염기서열 분석 테스트를 거칩니다. 이 효소는 5 단위/µL 농도로 공급되며, 최적화된 10배 농도의 반응 완충액이 함께 제공됩니다.

표준 Taq DNA 중합효소

아래 표를 참고하여 반응 조건에 적합한 Taq DNA 중합효소 혼합물을 선택하십시오. 염화마그네슘(MgCl₂)이 포함되거나 포함되지 않은 투명 또는 적색 염색 제형 중에서 선택하거나, 완충액과 dNTP가 포함된 미리 준비된 레디믹스(readymix) 또는 마스터믹스(master mix)를 선택할 수 있습니다.

단위 정의: 1단위는 74 °C에서 30분 동안 산 침전성 DNA에 총 10 nmol의 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산을 통합시킨 양을 의미합니다.

실험 절차: PCR 단계

Taq DNA 중합효소, 주형 DNA, 프라이머 및 MgCl₂의 농도에 대한 최적 조건은 사용되는 시스템에 따라 달라집니다. 각 구성 요소에 대한 최적 조건을 개별적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 이는 특히 Taq DNA 중합효소, 사이클링 매개변수 및 MgCl₂ 농도에 해당됩니다. 최적의 효율을 결정하기 위해 효소와 MgCl₂의 농도를 적정하는 것이 권장됩니다.

표에 제시된 순서대로 적정 크기의 튜브에 시약을 첨가합니다. (반응 설정에 적합한 표를 선택하십시오: 표준 시약 또는 레디믹스 시약.) 반응 횟수가 많은 경우에는 템플릿을 제외한 마스터믹스를 미리 준비하여 반응 튜브에 분주해야 합니다. 마지막 단계에서 템플릿을 해당 튜브에 첨가해야 합니다.

표준 PCR 반응

*버퍼와 Taq 폴리머라제를 함께 구매하세요: D1806, D4309 또는 D4545

레디믹스 PCR 반응

2. 보텍스로 부드럽게 혼합한 후, 잠시 원심분리하여 모든 성분이 튜브 바닥에 모이도록 합니다.

참고: 가열 뚜껑이 없는 열순환기를 사용하는 경우, 증발을 방지하기 위해 각 튜브 상단에 미네랄 오일 50 µL를 첨가하십시오.

3. 증폭을 수행합니다. 증폭 매개변수는 사용하는 프라이머와 열순환기에 따라 달라집니다. 개별 프라이머, 템플릿 및 열순환기에 맞게 시스템을 최적화해야 할 수도 있습니다.

일반적인 증폭 조건

25~30회의 증폭을 권장합니다.

4. 증폭된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동과 그 후의 에티디움 브로마이드 염색을 통해 확인할 수 있다.

참고: 미네랄 오일 상층액은 클로로포름(1:1)을 이용한 1회의 추출을 통해 제거할 수 있으며, 이 경우 수성 상을 회수할 수 있습니다.

핵산 전기영동용 시약

아가로오스 (사전 성형 겔, 분말 등)
MOPS-EDTA-아세트산나트륨, 트리스-아세트산-EDTA(TAE) 또는 트리스-보레이트-EDTA(TBE)와 같은 완충액
RNA용 젤 로딩 용액 및 시료 로딩 완충액
에티디움 브로마이드와 같은 전기영동 염색제 또는 염료

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