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중합효소 연쇄 반응(PCR) 애플리케이션

RNA 분리부터 증폭까지 RT-PCR 단계 - 역전사효소(RT) PCR은 RNA 또는 mRNA 분리, 프라이머 어닐링, 첫 가닥 합성, PCR 증폭의 단계를 따릅니다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 다양한 소스에서 특정 DNA 또는 RNA 서열을 효소적으로 증폭하는 효율적이고 신속한 <체외> 방법인 강력한 핵심 분자 생물학 기술입니다. 표준 PCR은 표적 DNA, 표적 DNA 서열의 측면에 있는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 열안정성 DNA 중합효소(일반적으로 Taq 중합효소) 및 뉴클레오타이드로 구성됩니다. 열 사이클러를 사용하여 각 증폭 주기에는 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 별도의 단일 가닥 DNA로 변성시키는 변성, 프라이머를 표적 DNA 서열로 어닐링하는 어닐링, DNA 중합효소가 프라이머에서 DNA를 연장하여 하나의 오래된 가닥과 하나의 새로운 가닥으로 새로운 dsDNA를 생성하는 연장의 세 단계가 포함됩니다. 한 사이클에서 합성된 가닥은 다음 사이클에서 주형 역할을 하여 단 20주기 만에 DNA의 양이 백만 배 증가합니다.

역전사효소 PCR(RT-PCR)

RT-PCR 또는 역전사효소 PCR은 매우 작은 샘플에서 얻은 특정 mRNA를 증폭하는 표준 PCR 기술의 변형된 형태입니다. 이 기술을 사용하면 기존 복제 기술에 필요한 지루한 mRNA 정제 과정이 필요하지 않습니다. RT-PCR에서는 표준 PCR 시약과 함께 역전사효소와 RNA 샘플이 사용됩니다. 반응 혼합물을 37˚C로 가열하면 역전사효소에 의해 RNA 샘플에서 상보적인 cDNA 사본을 생성할 수 있습니다. 그런 다음 이 cDNA는 프라이머 중 하나에 어닐링되어 첫 번째 가닥 합성을 유도합니다. 여기서부터 표준 PCR이 이어지며 최종적으로 dsDNA가 생성됩니다. RT-PCR은 세포와 조직에서 전사체 수준을 정량화하는 데 널리 사용되는 실시간 PCR(qPCR)과 자주 결합됩니다.

Hot Start PCR

Hot Start PCR은 열 활성화 단계가 발생할 때까지 반응 설정 중에 핫 스타트 Taq 중합효소 또는 변형된 dNTP의 결합을 억제하는 기술입니다. 핫 스타트 중합효소 활성을 억제하는 방법에는 화학적 변형, 항체 매개, 압타머 매개 방법 등 다양한 방법이 있습니다.

길고 정확한 표적 증폭을 위한 엔드포인트 PCR

엔드포인트 PCR은 종종 반응 완료 시 표적의 존재와 상대적 풍부도를 감지하는 데 사용됩니다. 표준 PCR 중에 생성되는 염기서열의 제한된 길이(약 5KB)는 '교정' 활동을 제공하는 추가 인자를 통합하여 부분적으로 극복할 수 있습니다. 길고 정확한(LA) PCR은 3′→5′ 엑소뉴클레아제와 함께 두 번째 열 안정 중합효소를 사용하여 말단 뉴클레오티드 오통합을 복구함으로써 충실도가 크게 향상되고 최대 40kb 길이의 DNA 표적을 증폭하는 능력을 제공합니다.